1.6 统计学处理

数据结果以x±表示，使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间的多重比较采用LSD法，P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 H2O2致兔肾小管上皮细胞形态的改变

不同浓度的H2O2作用兔肾小管上皮细胞24h后，显微镜下观察兔肾小管上皮细胞形态，如图1，随着H2O2浓度的增加，形态改变的细胞数量逐渐增多，贴壁细胞数量逐渐减少，部分细胞变长，细胞光泽度减小，体积缩小，H2O2浓度达550μmol·L-＇，轴突消失，胞膜破裂，细胞皱缩，细胞间隙增大，成片细胞间出现空白。

2.2 H2O2对兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响

分别使用350、400、450、500、550 μmol·L-＇H2 O2作用兔肾小管上皮细胞24h，采用MTT法测定吸光度，结果为不同浓度的H2O2对兔肾小管上皮细胞的增殖均有抑制作用，IC，值为439.07μmol·L-，500 μmol·L-＇的H2O2作用24h对细胞增殖的抑制作用可达到50％以上，因此选用该浓度作于后续研究。

2.3 H2O2对兔肾小管上皮细胞LDH的释放量的影响

H2O2作用兔肾小管上皮细胞24h后，采用非放射性细胞毒性检测方法测定细胞上清液及细胞裂解液中LDH反应的OD值，计算细胞LDH释放量，结果见表1．不同浓度的H2O2会引起兔肾小管上皮细胞LDH释放量的增加，且H2O2浓度越高，LDH释放量越大，呈浓度依赖性。H2O2在浓度400mmol·L-时引起细胞LDH释放量超过空白组50％以上，造成细胞重度损伤。

表1 H2O2对兔肾小管上皮细胞LDH释放量的影响（x±s．n＝4）Tah. 1 Effects of H,O,on LDH release from rabbit RTECS

注：与空白对照组比较＊P＜0.05＊＊P＜0.01

2.4 H2O2作用兔肾小管上皮细胞后AO／EB荧光染色结果

H2O2作用兔肾小管上皮细胞24h后，对细胞进行AO／EB荧光染色，如图2，初步判断H2O2对兔肾小管上皮细胞的作用机制以引起细胞坏死为主。不同浓度的H2O2会引起兔肾小管上皮细胞不同程度的坏死，H2O2浓度小于400μmol·L-时，核染色质着绿色收缩成圆形，判断主要以细胞早期凋亡为主，随着H2O2浓度升高，大于450μmol·L时，呈橘红非圆珠状，坏死细胞数量增多，呈浓度依赖性。

2.5 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响

兔肾小管上皮细胞在不同浓度（2、20、200mg-L-＇）的肉苁蓉水提、醇提物作用下，细胞存活率与无干预正常条件培养的细胞相比无显著差异。如图3，与模型组比较，肉苁蓉醇提物和水提物高浓度组能够显著降低H2O2对兔肾小管上皮细胞增殖的抑制作用（P＜0.01）。

图2 不同浓度H2O2作用兔肾小管上皮细胞AO／EB染色（100x）Fig,2 AO/EB staining of rabbit RTECs treated

by different concentrations of H2O2(100x)

2.6 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的影响

对细胞LDH释放量的影响结果如图4，肉苁蓉醇提物和水提物的高、中、低浓度组均使得H2O2作用后兔肾小管上皮细胞LDH释放量极显著低于模型组LDH的释放量（P＜0.01），结果呈浓度依赖性，浓度越高，细胞LDH释放量越低。

注：与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图4 肉苁蓉对H2O2作用兔肾小管上皮细胞后细胞LDH释放的影响

Fig 4 Effect of C. deserticola on H2O2-indueed LDH release from rabbit RTECs

3讨论

有“沙漠人参”之美誉的肉苁蓉具有极高的药用价值，是中国著名的补益中药《神农本草经》将上品药描述为“上药······主养命以应天，无毒，多服，久服不伤人···”肉苁蓉即被列为上品药，味甘，微温。《名医别录》指出肉苁蓉“味酸、咸，无毒”。之后历代本草对肉苁蓉性味归经的记载基本一致，其性微温，味甘、酸、咸，归肾、大肠经。传统用于肾阳不足、腰膝酸软、筋骨无力等，其药理作用及机制一直是研究重点。现代药理研究表明，肉苁蓉具有抗衰老、提高学习记忆能力、调节免疫功能。广泛用于中医临床处方、中成药和保健产品。

氧化应激是某些重大疾病的关键诱因，是由于体内活性氧在形成和清除之间出现失衡，造成组织细胞面临一定程度的氧化损伤。因而对应激反应机制进行深入研究，能够探寻有效预防、改善甚至完全消除应激性疾病的合理途径。氧化应激能够导致体内多种细胞及蛋白质过氧化例，研究选用H2O2作为损伤的外源物之一。具有强烈引发脂质过氧化的作用，引起链式脂质过氧化反应，造成细胞的凋亡和功能失调。目前研究这种外源物的肾毒性及拮抗其肾毒性作用主要是通过建立动物模型，建立体外模型进行相关研究的文献报道相对较

少。与肾毒性动物模型比较，体外肾毒性细胞模型具有作用靶点明确，用药周期短，用药量少等优点。

通过细胞形态学的改变、外源物对细胞增殖的抑制作用及细胞LDH释放量的改变对外源物诱导的体外肾毒性细胞模型进行研究。不同浓度的H2O2对细胞的形态改变均有明显的影响，随着外源物浓度的增加，发现细胞变形的数量增多。MTT实验是检测活细胞数量的常用方法，在不同浓度肉苁蓉保护兔肾小管上皮细胞免受H2O2损伤的实验中，不同浓度的肉苁蓉明显降低了H2O2对肾小管上皮细胞的抑制率，且具有浓度依赖性，当细胞胞膜

2.5 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞增殖作用的影响

兔肾小管上皮细胞在不同浓度（2、20、200mg-L-＇）的肉苁蓉水提、醇提物作用下，细胞存活率与无干预正常条件培养的细胞相比无显著差异。如图3，与模型组比较，肉苁蓉醇提物和水提物高浓度组能够显著降低H2O2对兔肾小管上皮细胞增殖的抑制作用（P＜0.01）。

图2 不同浓度H2O2作用兔肾小管上皮细胞AO／EB染色（100x）Fig,2 AO/EB staining of rabbit RTECs treated

by different concentrations of H2O2(100x)

注：与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图3 肉苁蓉对H2O2作用兔肾小管

上皮细胞后细胞增殖抑制作用的影响

Fig 3 Effeet of C. deserticala on the inhibition of H2O2-induced rabbit RTECs proliferation

2.6 肉苁蓉对H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的影响

对细胞LDH释放量的影响结果如图4，肉苁蓉醇提物和水提物的高、中、低浓度组均使得H2O2作用后兔肾小管上皮细胞LDH释放量极显著低于模型组LDH的释放量（P＜0.01），结果呈浓度依赖性，浓度越高，细胞LDH释放量越低。

注：与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图4 肉苁蓉对H2O2作用兔肾小管上皮细胞后细胞LDH释放的影响

Fig 4 Effect of C. deserticola on H2O2-indueed LDH release from rabbit RTECs

3讨论

有“沙漠人参”之美誉的肉苁蓉具有极高的药用价值，是中国著名的补益中药《神农本草经》将上品药描述为“上药······主养命以应天，无毒，多服，久服不伤人···”肉苁蓉即被列为上品药，味甘，微温。《名医别录》指出肉苁蓉“味酸、咸，无毒”。之后历代本草对肉苁蓉性味归经的记载基本一致，其性微温，味甘、酸、咸，归肾、大肠经。传统用于肾阳不足、腰膝酸软、筋骨无力等，其药理作用及机制一直是研究重点。现代药理研究表明，肉苁蓉具有抗衰老、提高学习记忆能力、调节免疫功能。广泛用于中医临床处方、中成药和保健产品。

氧化应激是某些重大疾病的关键诱因，是由于体内活性氧在形成和清除之间出现失衡，造成组织细胞面临一定程度的氧化损伤。因而对应激反应机制进行深入研究，能够探寻有效预防、改善甚至完全消除应激性疾病的合理途径。氧化应激能够导致体内多种细胞及蛋白质过氧化例，研究选用H2O2作为损伤的外源物之一。具有强烈引发脂质过氧化的作用，引起链式脂质过氧化反应，造成细胞的凋亡和功能失调。目前研究这种外源物的肾毒性及拮抗其肾毒性作用主要是通过建立动物模型，建立体外模型进行相关研究的文献报道相对较

少。与肾毒性动物模型比较，体外肾毒性细胞模型具有作用靶点明确，用药周期短，用药量少等优点。

通过细胞形态学的改变、外源物对细胞增殖的抑制作用及细胞LDH释放量的改变对外源物诱导的体外肾毒性细胞模型进行研究。不同浓度的H2O2对细胞的形态改变均有明显的影响，随着外源物浓度的增加，发现细胞变形的数量增多。MTT实验是检测活细胞数量的常用方法，在不同浓度肉苁蓉保护兔肾小管上皮细胞免受H2O2损伤的实验中，不同浓度的肉苁蓉明显降低了H2O2对肾小管上皮细胞的抑制率，且具有浓度依赖性，当细胞胞膜损伤时，胞内的LDH会释放到培养液中，细胞培养液中LDH含量是检测细胞死亡的一个重要指标。本研究发现H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤的模型组细胞培养液中LDH水平明显增加，而经不同浓度肉苁蓉处理之后的实验组细胞培养液中LDH水平明显减少，且存在浓度依赖性。研究结果提示，通过建立H2O2致兔肾小管上皮细胞损伤模型，初步探讨肉苁蓉提取物对肾小管上皮细胞的保护作用，不仅为氧化应激导致的细胞损伤相关研究奠定基础，也为肉苁蓉的开发利用提供基础数据。