刘明川，钟少达，杨进平，翁玲玲，杨胜杰，王昭日（杏辉医药集团杏辉天力（杭州）药业有限公司研究所，杭州 311100）

摘要：目的 研究肉苁蓉提取工艺条件及其神经保护作用。方法 利用生物酶对内苁蓉进行提取，通过单因素试验优选工艺条件，提取液经卷式膜纯化，冷冻干燥后获得肉苁蓉提取物，并对其进行抗氧化活性测试，再采用斑马鱼体内试验评价内苁蓉提取物对斑马鱼中枢神经损伤的保护作用。结果 最优工艺为加8倍量纯化水，温度为45～50℃，调整pH为7.0，加入药材质量0.1％的中性蛋白酶，搅拌2h，煮沸灭活后，经微滤卷式膜进行过滤，收集透过液。所制备的肉苁蓉提取物收率在60％以上，肽含量不低于20％，总苷含量在7％左右，糖类成分在63％左右。抗氧化活性测试表明肉苁蓉提取物对2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除作用（IC值分别为314.9μg＊mL-和393.5μg＊mL-＇），斑马鱼体内活性实验表明肉苁蓉提取物对班马鱼中枢神经损伤具有较好的保护作用。工艺具有绿色环保、操作简便等优点，所制备的肉苁蓉提取物具有较好的抗氧化和神经保护作用。

关键词：肉苁蓉提取物；生物酶；肽；抗氧化；神经保护

中图分类号：R284.2．R285.5     文献标识码：A     文章编号：1672-2981（2019）12-2020-07

doi:10.7539/j.issn.1672-2981.2019.12.002

苁蓉，又名大芸，主产于内蒙古自治区阿拉善盟和新疆维吾尔自治区的塔克拉玛干沙漠。中医称其为地精或金笋，是极其名贵的中药材，素有“沙漠人参”之美誉，历史上就被西域各国作为上贡朝廷的珍品州。沙漠肉苁蓉 Cistanche deserticola Y.C.Ma和德赢vwin登录 Cistanche tbulosa（Schrenk）Wight是主要 品种，已被《中国药典》（2015年版一部）收录均。肉苁蓉具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年等功效，主治男子阳痿，女子不孕、带下、血崩，腰膝冷痛，血枯便秘等制。在历代增力中药处方中出现率占第1位，而在抗老防衰类方剂中仅次于人参，占第2位。肉苁蓉在我国已有两千多年的使用历史，现代药理学研究表明，肉苁蓉除能补肾壮阳外，更兼有抗衰老、增强记忆力、提高免疫力等多种功能叫。

从20世纪80年代开始，国内外对肉苁蓉的化学成分进行了大量研究，结果证实了苯乙醇苷类、糖类、蛋白类为肉苁蓉的主要成分。苯乙醇苷类具有抗氧化、抗衰老、调节神经内分泌系统等生物活性；糖类物质可以提高小肠推进度，达到通便润燥的功效，同时还有提高记忆力的作用；蛋白类成分约占肉苁蓉药材的10％～20％，可以提高机体免疫力，增强体质。目前获得苁蓉提取物最普通的方法是水提取法和有机溶剂提取法，两种方法可以将苁蓉中的苯乙苷类和糖类成分提取出来，但蛋白类成分很难提取彻底，而且两种方法需要多次提取，得率不高，造成资源利用率低。

为了简化肉苁蓉提取物的制备工艺，避免有毒试剂的使用，提高肉苁蓉提取物的收率，同时满足大规模生产，本文拟研究肉苁蓉的提取工艺，并期望获得的肉苁蓉提取物中富含较易吸收的小分子肽类、苷类和糖类成分，再通过斑马鱼体内实验评价肉苁蓉提取物的神经保护作用。

1 材料

R-210型旋转蒸发仪、V-700型真空隔膜泵、K-436快速消解仪和K-360凯氏定氮仪（瑞士步琪公司）。RET control-visc磁力搅拌器（德国IKA公司），A300全自动氨基酸分析仪（德国曼默博尔公司），1525型

高效液相色谱仪（美国Waters公司），Lambda 35型紫外可见分光光度计（美国PerkinElmer公司），Milli-QReference纯水机（美国Millipore公司），XS-205型1／10 万电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），FreeZone型冷冻干燥机（美国Labconco公司）。肉苁蓉药材（浙江南方药材有限公司，经台湾国防医学院林汉钦教授鉴定为列当科肉苁蓉属植物肉苁蓉 Cistanche deserticolaY．C．Ma干燥的肉质茎，符合2015年版《中国药典》规定，样品编号20180122，并将其粉碎过四号筛网），D．无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110833-2012050．纯度：99.9％），松果菊苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111670-201706，纯度：89.7％），菠萝蛋白酶（酶活力为30万U·g＇）、木瓜蛋白酶（酶活力为40万U·g）、中性蛋白酶（酶活力为30万U·g＇）、碱性蛋白酶（酶活力为20万U·g＇）以及酸性蛋白酶（酶活力60万U·g＇）均为食品级，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 提取工艺中工具酶的筛选

采用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶对肉苁蓉进行提取，具体步骤为：取100g肉苁蓉药材，固定料液比1：6（g／mL）加入纯化水，用浓度均为1mol·L-的盐酸和氢氧化钠调节每种酶的最适pH，加入药材质量0.05％的蛋白酶，在各个酶的最适温度恒温搅拌。反应1、2、4、6、8、10h时取样10mL，煮沸灭活，离心过滤后，取滤液，测定肽、总苷和总糖含量，作含量与提取时间的变化曲线。

2.2 酶提取工艺单因素考察试验

考虑到生物酶法制备肉苁蓉提取物的影响因素，设计考察5个单因素：时间、酶用量、料液比、温度、pH值。

2.3 肽含量测定

2.3.1 酸溶性蛋白质含量的测定 精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量至10mL量瓶中，加适量15％三氯乙酸，充分溶解后，再加15％三氯乙酸至刻度。过滤后，取全部滤液按凯氏定氯法测定可溶性蛋白质的含量。