2.3.2 游离氨基酸含量的测定 精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加pH＝2.2的柠檬酸钠缓冲溶液制成100mg·mL-＇的肉苁蓉提取物溶液，用氨基酸自动分析仪以外标法测定氨基酸的含量。

2.3.3 肽含量的测定 酸溶性蛋白与游离氨基酸测定值的差值即为肽含量。

2.4 苁蓉总苷的含量测定P

2.4.1 松果菊苷

①色谱条件：采用YMC-Pack Pro C1s色谱柱（4.6mmx150mm，5μm），流动相甲醇-0.15％醋酸水溶液（30：70），流速1.0mL·min＇，检测波长333nm．柱温40℃，进样量10μL。

②对照品溶液：精密称取松果菊苷对照品适量，加50％甲醇制成0.1mg·mL-＇（经折算后）的溶液。

③供试品溶液：精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加50％甲醇适量制成0.3mg＊mL-＇的肉苁蓉提取物溶液。

④测定法：分别取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高相液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法计算松果菊苷的含量。

2.4.2 苁蓉总苷

①对照品溶液：精密称取松果菊苷对照品适量，加50％甲醇制成0.1mg＊mL-（经折算后）的溶液。

②供试品溶液：精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加50％甲醇适量制成20μg＊mL-＇的肉苁蓉提取物溶液。

③标准曲线的制备：精密移取对照品溶液1、2、3、4、5mL置50mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，按紫外-可见分光光度计法测定，在333nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

④测定法：取供试品溶液在333nm波长处测定吸光度，从标准曲线读取含量，按照下式计算苁蓉总苷的含量，即得。

Q=(01-02)x(624/786)+Q

Q为肉苁蓉提取物中苁蓉总苷的含量（％）；01为以松果菊苷为对照测得肉苁蓉提取物冻干粉中苁蓉总苷的含量（％）；O2为高效液相色谱法测得肉苁蓉提取物冻干粉中松果菊苷的含量（％）。

2.5 总糖的含量测定

2.5.1 对照品溶液 精密称取D-无水葡萄糖对照品适量，加纯化水适量制成100μg·mL-的溶液。

2.5.2 供试品溶液 精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，加纯化水适量制成50μg·mL-的肉苁蓉提取物的溶液。

度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。2.5.4 测定法 分别精密移取“2.5.1”项下对照品溶液1.0mL和纯化水1.0mL置于25mL比色管中，加入1.0mL苯酚溶液（50mg·mL-＇），混匀后，小心加入浓硫酸5.0mL，再煮沸2min，取出10min后，在波长489nm处测定吸光度，根据标准曲线计算总糖含量。

2.6 抗氧化能力的测定

2.6.1 DPPH自由基清除能力 准确称取DPPH粉末适量，用无水乙醇溶解并定容，配制浓度为40μg＊mL-的DPPH乙醇溶液。精密称取抗坏血酸（阳性对照）以及肉苁蓉提取物冻干粉适量，分别用乙醇溶解并定容，配制样品乙醇溶液。移取2mL样品乙醇溶液和2mLDPPH乙醇溶液混合均匀（4）；移取2mL供试品溶液和2mL乙醇混合均匀（4，）；移取2mLDPPH溶液和2mL乙醇混合均匀（A。），室温放置30min，在515nm波长处测定吸光度，并根据以下计算公式计算自由基清除率（IR）：IR％＝［1-（4-4，）／A］x100％。

2.6.2 ABTS自由基清除能力 准确称取适量ABTS粉末用纯化水溶解并定容，制成4mg＊mL-的ABTS溶液。准确称取适量过硫酸钾用纯化水溶解并定制成4mg·mL-的过硫酸钾溶液。移取352μL过硫酸钾溶液加入至20mLABTS溶液中，摇匀，静置过夜后移取1mL与65mLPBS缓冲溶液混匀，制成ABTS工作液。精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，用纯化水溶解并定容，配制样品溶液。准确移取0.5mL样品溶液和5mLABTS工作溶液混合均匀（A）；准确移取0.5mL样品溶液和5mLPBS缓冲液混合均匀（4）：准确移取5mLABTS工作溶液和0.5mL PBS缓冲液混合均匀（A。）．立即在734nm处测定吸光度，计算自由基清除率，计算公式同“2.6.1”项下。

2.6.3 超氧阴离子自由基清除能力（SRSA）准确移取1mL0.1moL·L-PBS缓冲液（pH＝7.4）于 量瓶中，加入1mL150μmoL·L-氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液，2mL468μmoL·L-还原型辅酶I（NADH）溶液，1mL 60 μmoL·L-过一硫酸盐（PMS）溶液，搅拌均匀，25℃下反应5min，制成工作液。精密称取肉苁蓉提取物冻干粉适量，用PBS缓冲液溶解并定容，配制样品溶液。准确移取0.5mL样品溶液和5mL工作溶液混合均匀（4，）；准确移取0.5mL供试品溶液和5mL纯化水混合均匀（A，）；准确移取5mL上述工作溶液和0.5mL纯化水混合均匀（A。）．立即在560nm处测定吸光度，并计算自由基清除率，计算公式同“2.6.1”项下。

2.7 对班马鱼神经损伤保护作用的评价

2.7.1 实验动物 野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行，年龄为受精后1d。以上斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1L反渗透水中加人200mg速溶海盐，电导率：480～510μS·cm：pH为6.9～7.2；硬度：53.7～71.6mg·L-＇CaCO，）． 实验动物使用许可证号为：SYXK（浙）2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

2.7.2 最大耐受浓度的测定 随机选取960尾受精后1d的野生型AB品系斑马鱼胚胎于六孔板中，每孔（实验组）均放置30尾斑马鱼，用3mL吗替麦考酚酯（0.4 μmol·L-）诱发斑马鱼中枢神经损伤，同时分别加入用水配制浓度为125、250、500、1000和2000μg·mL-的肉苁蓉提取物溶液各3mL，同时设置正常对照组（加养鱼水）和模型组（只加吗替麦考酚酯）。供试品处理期间，每日对死亡的斑马鱼计数并移除死鱼。处理24h后，观察记录斑马鱼的表型（体型变化和毒性表现）和死亡情况，确定斑马鱼对供试品的最大耐受浓度（MTC）。

2.7.3 神经损伤保护作用 随机选取受精后1d的野生型AB品系斑马鱼于六孔板中，每孔（实验组）均放置30尾斑马鱼，用吗替麦考酚酯（0.4μmol·L-＇）诱发斑马鱼中枢神经损伤模型，同时分别给予一定浓度的肉苁蓉提取物溶液或154μg＊mL-的谷胱甘肽（阳性对照组），同时设置正常对照组（加养鱼水）和模型组（只加吗替麦考酚酯）处理24h后，用吖啶橙进行染色，染色后每个实验组随机选取10尾斑马鱼在荧光

显微镜下拍照并保存图片，用NIS-Elements D 3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算斑马鱼中枢神经（脑和脊髓）凋亡细胞的光强度（S），根据凋亡细胞荧光强度的统计学分析结果评价供试品对斑马鱼中枢神经的保护作用。统计学处理结果用mean±SE表示，中枢神经的保护作用计算公式为：中枢神经保护作用（％）＝（Smmm-S供试m）x100％／（Smmm-S正常照）。用方差分析和Dunnett＇st-检验进行统计学分析，P＜0.05表明差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 工具酶的筛选

肉苁蓉含有10％～20％蛋白类成分，由于蛋白类成分水溶性差，较难使用常规的工艺提取，因此在其提取液中添加生物蛋白酶进行提取。蛋白酶的引入，可将药材中大分子蛋白水解成水溶性较好的小分子肽类，从面增加蛋白类的提取率。

本文用菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶进行提取，提取液浓缩冷冻干燥，测定肽、总苷和总糖的收率，并作其与时间的关系曲线，如图1所示。

图1 不同蛋白酶提取3种成分收率时间曲线

Figl Effect of different preteases extraction time on the extration rates of 3 component

A.肽收率（peptide）；B.总苷收率（glycoside）；C.总糖收率（polysaccharide）

如图1A所示，菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及酸性蛋白酶对肽的提取率均随着提取时间的延长而提高，但在2h后，提高较为缓慢。其最高提取率分别为6.1％、8.2％、11.5％、8.1％和4.1％．可见中性蛋白酶效果最好。5种酶对总苷的提取和总糖的收率也是随着提取时间的延长而提高，2h后基本达到平衡（见图1B和IC）。中性蛋白酶和碱性蛋白酶对总苷的提取效果基本一致，菠萝蛋白酶和酸性蛋白酶提取效果不佳。图1C显示碱性蛋白酶比中性蛋白酶更有助于对总糖的提取，但差异无统计学意义。综合对这3种成分提取率的考虑，本文选择中性蛋白酶作为肉苁蓉提取物工艺中的最佳工具酶，为提高中性蛋白酶的提取效率，将进一步进行提取条件单因素考察。

3.2 酶提取条件单因素试验

0.4％、0.6％的中性蛋白酶，搅拌2h后，提取液浓缩冷冻干燥，测定肽、总苷和总糖的收率，结果见表1。由表1可知，这3种成分的收率在加酶量为0.1％时较高，加酶量继续增加，收率提高缓慢，可见蛋白酶添加量为药材质量的0.1％时为最佳用量。

表1 酶的用量对3种成分收率的影响（n＝3）

Tab l Effect of pretease dosage on the extration rates of the three components(n=3)