杨志蓉1.3 2.3 甘世祥 冯书堂

朱桂玉

（1．贵阳中医学院，贵阳 550002）（2．曲阜师范大学，山东曲阜 273100）

（3．中国农业科学院畜牧研究所，北京 100094）

摘要：目的 探讨肉苁蓉水提液对猪早期体外发育胚胎中一氧化氮浓度的影响，以研究肉苁蓉促进猪胚胎发育的药理作用。方法 将采集的猪卵母细胞随机分为试验组和对照组，试验组在胚胎培养时在基础液中加入50tg／mL肉苁蓉水提液。将培养至囊胚阶段的胚胎取出，用Griee试剂法测定囊胚细胞中NO含量，结果 细胞中NO含量显著低于对照组（P＜0.05），结论 肉苁蓉水提液减少了胚胎细胞中NO含量，这可能是其促进细胞体外发育的作用机理之一。

关键词：肉苁蓉；一氧化氮：体外发育：猪：胚胎

中图分类号：R915 文献标识码：A 文章编号：1006-6179（2007）04-0027-03

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉（Citache deseticolaMa）的干燥带鳞片的肉质茎，其味甘、咸，性温。归肾、大肠经。中医学认为其功效主要有温肾壮阳、补肾益精、润肠通便。现代研究表明具有清除氧自由基的作用。一氧化氮（NO）广泛存在于各种细胞中，在哺乳动物的心血管系统、神经系统、免疫系统和生殖系统等正常的生理活动和病理变化中发挥着十分重要的作用。NO在生殖相关过程中扮演了重要角色，包括配子的发生、类固醇激素的生成、卵泡的排卵、卵母细胞的减数分裂和成熟、配子的受精、受精卵的卵裂、胚胎着床及细胞凋亡等等，这已经在大鼠、牛、兔、猪等多种哺乳动物得到了证实。正常的胚胎发育需要NO的调节，也就是说，哺乳动物胚胎在生长过程中自身产生的NO是胚胎正常发育所必需的，并参与胚胎的分裂分化。

在胚胎的体外培养过程中，体外培养胚胎的发育率和质量远不如体内胚。其原因很多，是否与胚胎在体外发育过程中产生了的过多NO有关？本试验在对NO前期研究的基础上，对培养到囊胚阶段的胚胎中NO含量进行了测定，观察添加中药是否对胚胎NO含量产生影响，以期揭示肉苁蓉促进胚胎发育的药理机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 主要仪器设备：超净工作台，江苏净化设备有限公司：体视显微镜 SMZ1000，Nikon Japan；二氧化氮培养箱，NUAIRE US：融合仪 ECM 2001．BTXUS：超纯水净化装置 Biocell，Milli-Q.US：酶标仪318-MIC，上海三科精密仪器有限公司。

1.1.2 主要药品与试剂：本试验所用试剂除特殊说明外均购自 Sigmm公司。PMSG HCG，宁波市激素制品有限公司：总NO检测试剂盒S0023，碧云天生物技术研究所：RIPA裂解液P0013D，碧云天生物技术研究所。

1.1.3 肉苁蓉水提液的制备：取5g肉苁蓉用适量Milli-Q水浸泡30min后，大火煎煮，水沸腾后改为文火煎煮20min：煎煮3次合并煎煮液并定溶至100mL，使其终浓度为每毫升含生药50mg的肉苁蓉水提液：高压灭菌后4℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 卵母细胞的采集：从屠宰场收集刚刚屠宰的猪卵巢，保存在加有30℃～36℃灭菌并添加双抗的生理盐水的洁净保温瓶内，在2～3h内尽快送回实验室，然后用相同温度和同样的生理盐水清洗2～3次，再用带有18号针头的10mL无菌注射器抽取直径2～8mm卵泡中的卵母细胞，2h内抽完。将抽取液缓慢注入置于38℃恒温水浴锅的50mL离心管中，使卵母细胞自然沉降，用滴管吸去上清液。

1.2.2 卵母细胞的体外成熟培养：在沉淀好的液体中加入PVA-DPBS，将沉淀物倒入划线的60mm培养皿中，在体视显微镜下用口吸管迅速挑出胞质均匀、且有3层以上完整致密的卵丘细胞包裹的卵丘细胞一卵母细胞复合体（Camulus＂oocytes＂compleses. Cocs），用预热的成熟培养液洗涤3遍，移入成熟培养液中，在39℃、5％CO2培养条件下培养。Cocs先在成熟培养液中培养20h±2h．然后转移到无PMSG和HCG的成熟培养液中培养。

1.2.3 卵母细胞的孤雌激活：卵母细胞培养44h后，移入含0.1％的透明质酸酶的小管中，用100L枪头吹打脱去颗粒，获得无颗粒细胞的卵母细胞，然后在显微镜下挑出有第一极体且胞质均匀的卵母细胞用于激活。

将形态较好且有第一极体的卵母细胞转移到无钙H-NCSU-23（Hepes bxffered NCSU-23．HN）中洗涤3 遍，再转移到融合液中平衡20s，每批50个左右，放入已经有融合液的融合槽中（电极宽度为500／m。美国BIX），用ECM2001融合仪施加一个30,1.6kV／cm的直流电脉冲来诱导激活。取出处理的卵母细胞，用NCSU-23＋0.4％BSA＋10ng／mL．CB中洗涤3遍后，进行胚胎培养。

1.2.4 胚胎培养：将洗涤干净的胚胎移入NCSU-23＋0.4％BSA＋10mg／ml．CB中培养4～6h后，再移入无CB的NCSU-23＋0.4％BSA中，在39℃、5％CO：培养条件下进行培养。培养方法用微滴培养法，液滴的大小为50L，每滴放20～25枚卵，培养144h后进行NO含量测定。

1.2.5 NO含量测定：采用硝酸盐还原酶法。按照试剂盒说明书进行操作，根据标准液不同浓度梯度绘制标准曲线，计算回归方程，利用标准曲线方程进行样品NO含量计算。

1.3 实验设计202China Academic oumal Electronic

试验设试验组和对照组，试验组在胚胎阶段在基础培养基（NCSU-23＋0.4％BSA）中添加50tg／ml

浓度的肉苁蓉水提液1L，对照组不添加任何试剂。将培养至囊胚阶段的胚胎取出，按照试剂盒上的操作步骤说明-检测胚胎细胞中NO的含量。

1.4 数据处理

将试验中获得的数据用士。形式记录，用SPSS11.5软件对数据进行处理，数据采用：检验。

2 结果

以配的标准液的不同浓度梯度测得其相应的OD值-根据测得的OD值与其对应的浓度梯度，绘制标准曲线，求得回归方程为：

y=0.0026x+0.0908(r=0.9578)

再根据标准曲线回归方程得出NO含量，见表1。

表1 囊胚细胞中 NO含量测定结果

注：不同小写字母之间表示差异显著（P＜0.05）。

由表中可以看出，经过体外培养到囊胚阶段，胚胎细胞中NO含量均较高，但添加肉苁蓉水提液后其胚胎细胞中NO含量明显降低，与对照组有显著性差异（P＜0.05）。

3讨论

NO作为一种细胞间及细胞内信息分子，广泛存在于各组织器官的各种细胞中，参与机体的生理，病理调节过程，其在生殖系统中的作用已引起生殖学家的重视。现已确认，NO参与几乎所有生殖活动，在雌性表现为类固醇激素的生成、卵泡发育、排卵和闭锁、卵母细胞的减数分裂成熟、受精、妊娠以及胚胎的发育等。在雄性表现为参与精子的发生、睾酮的分泌和睾丸内血流的调节等生理过程。在大多数组织中，NO作为细胞间信号的传递体是通过激活GC来实现的。现有的资料表明，L-Arg-NO-cGMP通路在人类和动物多种组织和细胞中广泛存在，它代表着一种细胞间信息传递和细胞功能调节的新的信号传导机制。当前在很多研究中都发现NO的作用具有双重性，如Bu等的研究就证明了NO对于卵母细胞的体外成熟就具有双向调节的作用。一方面，NO作为重要的信使分子，参与细胞信号转导过程：另一方面，作为一种自由基，NO又具有细胞毒性，这取决于局部NO的生成量。当局部NO的浓度升高至／mol／L级水平时，它即可与周围的超氧阴离子（O2-）迅速反应，生成过氧亚硝基阴离子（peraxynitrite.ONOO）.ONOO是一种强氧化剂，可 有效地氧化蛋白质巯基、铁硫中心（Fe／s）、锌指结构、硝基化蛋白质的酪氨酸残基，使许多重要的蛋白质或酶失活，影响细胞代谢，并抑制呼吸链酶，破坏线粒体结构，使DNA链断裂，而致细胞死亡，并可启动脂质过氧化，从而导致组织损伤。ONNO在低于生理pH值时，分解为更强的自由基，具有很大的细胞毒性。

我们在试验中发现，经过体外培养后，到囊胚阶段细胞中NO含量均超过了＃md／L水平，也就是说其内所含的NO的量已对细胞产生毒性作用。这可能是导致体外培养胚胎发育率和质量不如体内胚的原因之一。因为在体外培养的过程中，不可避免地会产生氧自由基，加之NO不稳定，化学性质活泼，常与氧、超氧自由基或由氧衍生的自由基以及氧合血红蛋白发生反应凹，从而引起对细胞的毒性作用，导致细胞停止发育或死亡。肉苁蓉是中药中的一味补肾药，具有温肾壮阳、补肾益精的功效。在临床上常用于不孕不育症的治疗，其所含的有效成分肉苁蓉总苷、多糖均具有抗氧化、清除体内氧自由基的作用，能对抗胚胎发育过程中所产生的氧自由基，促进胚胎的发育。王晓雯等叫报道了肉苁蓉具有抗氧化作用及对OH·引发的DNA损伤的保护作用。李琳琳等“证实了肉苁蓉总苷的抗脂质过氧化作用，孙云的研究也证明了肉苁蓉具有对抗自由基损伤的作用。本研究在试验组中添加了肉苁蓉水提液，在一定程度上清除了胚胎在体外培养过程中所产生的自由基，减少了NO的生成，从而提高了胚胎体外发育率，这也可能是肉苁蓉促进胚胎体外发育的原因。