摘要: 研究肉苁蓉及淫羊藿对小鼠早期胚胎体外发育的影响。试验选取6 ～ 8 周龄昆明小鼠早期胚胎，以不添加中药培养液组为空白对照，分以下试验组: I 组: 早期胚胎在纯培养液M16 + 5% FBS( M1) 与M16 + 5% FBS +

EDTA + 牛磺酸( M2) 中的体外发育情况; Ⅱ组: 早期胚胎添加至中药体积浓度为0． 1% 的M1与M2培养液中。Ⅲ组: 早期胚胎添加至不同体积浓度中药成分的培养液中。Ⅳ组: 将早期胚胎加入中药不同组合体积浓度培养液中。试验结果: ( 1) M2液优于M1液，特别是在克服2 细胞发育阻滞上。( 2) 添加0． 1%肉苁蓉桑葚胚率与囊胚率高于0． 1%淫羊藿组，差异极显著( P ＜ 0． 01) ，中药组桑葚胚率与囊胚率显著高于培养液空白对照，差异极

显著( P ＜ 0． 01) 。( 3) 高浓度中药会对胚胎活力产生副作用，抑制胚胎后阶段发育，与其他组对比差异极显著( P ＜ 0． 01) 。( 4) 添加高浓度中药组合培养液对早期胚胎成活率、2 细胞发育率，与低浓度组合中药和空白组

相比有显著差异性( P ＜0． 05) ，与低浓度组合中药和空白对照相比桑葚胚及囊胚发育率差异极显著( P ＜ 0． 01) 。在小鼠胚胎体外培养液中添加一定浓度EDTA、牛磺酸能克服2 细胞阻滞; 0． 1% 肉苁蓉能有效促进胚胎体外发育，同时添加低浓度中药及低浓度组合中药也有促进作用。

关键词: 肉苁蓉; 淫羊藿; 卵母细胞; 体外培养

随着胚胎生物工程研究的发展，人们对早期胚胎发育与微环境、自身代谢特征等方面的认识在不断深入，目前大多数研究者普遍采用改变培养液的成分、改善培养的条件提高胚胎发育率，并建立了胚胎共培养体系。传统中药相对于化学药物来说具有经济、低毒等明显的优点，目前国内外在研究中药对胚胎体内外发育的影响方面几乎都在研究中药有效成分中多糖类和黄酮类抗自由基的特性，而从中药全药的特性出发来研究中药对早期胚胎发育的影响方面，国内外报道不多。本研究在前人基础上探索如何进一步提高早期胚胎体外发育率，研究添加中药对孕期胚胎发育的影响。

1 材料与方法

1． 1 试验材料

1． 1． 1 动物及药材6 ～ 8 周龄清洁级昆明小鼠( 购自新疆医科大学实验动物中心) ，雌性120 只，雄性20 只，体质量18 ～ 22 g，实验动物生产许可证号SCXK( 新) 2003 － 2002，使用许可证号: SY( 新) 2003 －003。肉苁蓉及淫羊藿原药材，均购自乌鲁木齐市百草堂大药房。

1． 1． 2 仪器设备及试验试剂Motic K 系列倒置显微镜; NikonT － SAM 倒置显微镜( NT － 88 － V3， Japan); 手术器械( 苏州六六视觉) ; 拣卵针( 自制) ; 5%FBS( 杭州四季青) ; DPBS + 0． 5%PVP 冲胚液; Galaxy－ 48R CO2培养箱( New brunswick) ; 微量移液器( Eppendorf) ; 96 孔细胞培养板( greiner bio － one) ;青、链霉素( 华北制药股份有限公司) ; M16培养液( Sigma) ; EDTA( 天津福晨化学试剂厂) ; 牛磺酸( 国药集团化学试剂有限公司) 。

1． 2 试验方法

1． 2． 1 小鼠发情鉴定及合笼购回小鼠后随机分笼饲养1 周，待其适应环境后备用，参照李聚学等［1］制定的判断标准，采用阴门直接观察法进行鉴定，将处于发情盛期的母鼠于当日下午19: 00 左右按1∶ 1比例与公鼠合笼过夜，次日08: 00 左右检查阴道栓，见栓当日记为第0 天，将见栓小鼠标记置于笼中饲养，给予人道关怀，自由采食与饮水，备用。

1． 2． 2 中药肉苁蓉及淫羊藿的熬制取5 g 原药置于100 mL 烧杯中并加Milli － Q 水浸没，经大火煮沸与文火维持沸腾20 min 后收取药汤，重复以上过程连续收取3 次后定容至100 mL 后0． 22 μm 滤膜过滤备用。

1． 2． 3 小鼠早期胚胎的获取及形态鉴定于见栓后第0． 5 天将见阴道栓小鼠颈椎脱臼处死，φ = 75%酒精浸泡5 min，无菌打开腹腔，用手术剪和手术镊剪下输卵管迅速将其置于冲胚液中洗涤数遍，去除血渍，在倒置显微镜下用连有1 mL 注射器的5 号针头将输卵管壶腹部明显膨大处撕破，冲出卵丘－ 卵母细胞团，置于添加有青链霉素的培养皿中清洗后即得到小鼠早期胚胎。

1． 2． 4 胚胎的培养本试验采用96 孔板微滴法( 50 μL /滴， 10 － 15 枚/滴) 培养，收集小鼠早期胚胎，分别加入经过5%CO2、37 ℃饱和湿度的CO2培养箱平衡4 h 后的M16 + 5%FBS( 标记为M1液) 和M16

+ 5%FBS + EDTA + 牛磺酸中( 标记为M2液) ( 牛磺酸添加浓度为215 mmol /L 即0． 027 g /mL; EDTA 添加浓度为100 mmol /L 即0． 037 g /mL) ，每24 h 观察记录胚胎发育情况，待胚胎在M16 + 5%FBS + EDTA

+ 牛磺酸培养液中培育越过2 细胞阻滞期后将胚胎换液转入M16 + 5%FBS 中继续培养。按10 ～ 15 枚/组/滴进行分组: ( 1) 纯培养液组: 将M1、M2培养液分别加入96 孔板内，加入早期胚胎并对比观察其在培养液中发育情况。( 2) 等体积浓度中药组: 分别添加0． 1%( V/V) 浓度的肉苁蓉与淫羊藿中药至M1液和M2液中，与不添加中药成分空白组M1液、M2液对照，加入早期胚胎，观察胚胎发育情况，判断2种中药成分是否对早期胚胎体外发育有效果。( 3) 不同浓度中药组: 将早期胚胎分别放入到加有0%( 空白对照) 、0． 15% ( V/V) 、0． 2% ( V/V) 肉苁蓉和淫羊藿的M1、M2两种培养液中， 96 孔板培养，判断不同浓度的肉苁蓉及淫羊藿对早期胚胎发育的影响。( 4) 不同组合浓度中药组: 设定2 种中药不同的组合浓度: A: 0． 1%肉苁蓉+0． 1%淫羊藿组; B: 0． 15%肉苁蓉+0． 1%淫羊藿组; C: 0． 2%肉苁蓉+0． 1%淫羊藿组; D: 0． 1%肉苁蓉+ 0． 15%淫羊藿组; E: 0． 1%肉苁蓉+ 0． 2%淫羊藿组; 空白对照组: 不添加中药成分空白组M1液与M2液，加入早期胚胎观察发育情况。

1． 3 测定指标

1． 3． 1 早期胚胎形态学评级及成活率测定胚胎形态评级参照王敏康等［2］建立的标准，显微镜下选择胞质与透明带完整，无碎片，颜色透亮的Ⅰ级胚胎备用。

1． 3． 2 早期胚胎发育情况及发育率测定胚胎发育情况按照小鼠胚胎发育图谱与标准［2］鉴定，记录胚胎所处各个时期发育情况及数目并计算胚胎发育率。

1． 4 数据处理

所有数据采用SPSS17． 0 进行分析。

2 结果与分析

2． 1 早期胚胎在2 种培养液中的体外发育情况( 存活情况及发育率)由表1 可以看出在2 种不同培养液中，早期胚胎成活率均较高( P ＞ 0． 05) ，由卵母细胞发育至2 细胞过程中发育率无显著差异( P ＞ 0． 05) ，但2 组培养液桑葚胚与囊胚发育率差异极显著( P ＜ 0． 01) ，表明M16 + 5%FBS + EDTA + 牛磺酸培养液( M2液) 在体外培养早期胚胎时优于M16 + 5%FBS 培养液( M1液) ，特别是在克服2 细胞发育阻滞率上具有显著优势。

2． 2 添加2 种中药成分对不同培养液中早期胚胎体外发育的影响

由表2 可以看出添加中药后早期胚胎成活率较高，与不添加中药组对比无显著差异( P ＞ 0． 05) ，添加0． 1%肉苁蓉桑葚胚率与囊胚率均显著高于0． 1% 淫羊藿组，差异极显著( P ＜ 0． 01) ，中药组桑葚胚率与囊胚发育率显著高于培养液空白对照组，差异极显著( P ＜ 0． 01) 。说明添加一定浓度中药成分能有效促进胚胎发育，其中以添加0． 1%肉苁蓉效果为最佳。

2． 3 2 种中药成分不同添加浓度对鼠胚早期发育的影响

由表3 可以看出添加高浓度中药后，胚胎成活率显著降低，与M2液对比有显著差异( P ＜ 0． 05) ，说明高浓度中药会对胚胎活力产生一定副作用，同时过高浓度中药可能会抑制桑葚胚与囊胚发育率，与其他组对比差异极显著( P ＜ 0． 01) 。

2． 4 2 种中药不同组合浓度对鼠胚早期发育的影响

由表4 可以看出添加高浓度中药组合培养液使早期胚胎成活率、2 细胞发育率也显著降低，与低浓

度组合中药和空白对照组相比具有显著差异性( P ＜ 0． 05) ，同时，在桑葚胚发育率及囊胚发育率上，与低浓度组合中药和空白对照组相比具有极显著差异性( P ＜ 0． 01) ，同样说明高浓度中药组合培养液可能对发育率有抑制作用。

3 讨论

3． 1 添加EDTA 及牛磺酸对胚胎体外发育影响

影响胚胎体外发育的因素很多，涉及物种、血清、培养基、培养环境、生长因子等［4 － 5］，其中培养环境是一重要因素，哺乳动物子宫内环境与胚胎体外培养环境有很大差异，体外培养发育的胚胎在发育过程中会产生并累积一些不利于发育的毒性物质，比如自由基、NO 等，这对处于体外发育环境中的胚胎具有不利影响，会降低其成活率及发育率，因此会发生发育阻滞，杨清等［6］研究证明NO 作为一种调节因子参与早期胚胎的发育，当生成过量时对胚胎有损害作用。古丽努尔［7］报道中药成分能在一定程度上消除NO 自由基，同时Ricci［8］报道小鼠正常子宫内含有一种上皮细胞液，当在体外培养环境中添加这种子宫上皮液时能使早期胚胎越过2 细胞发育阻滞。本试验发现在培养液适当添加一定浓度的EDTA与牛磺酸，希望其能替代体内环境中所需的特殊物质，在本实验中其作用也很明显，胚胎体外发育率显著高于对照组，说明EDTA 与牛磺酸在一定程度上清除体外培养环境中的毒性因素，起到了替代子宫内某种特殊物质的作用。这一结果与相关报道［9 － 11］一致。同时有报道表明［12 － 14］，EDTA 和牛磺酸的添加浓度过高会造成胚胎发育率降低甚至死亡，其机理是否是过量化学物质对胚胎发育过程中相关细胞因子产生了变化影响，这将在本人后续试验中验证。

3． 2 添加中药及其浓度变化对胚胎体外发育影响

在早期胚胎体外培养过程中，适当添加中药可以促使卵母细胞改善胞质成熟质量，促进胚胎的体外发育，肉苁蓉及淫羊藿做为传统壮阳补肾药［15］，具有补肾益精、促进生殖发育的功效，故本试验将2 种滋阴壮阳中药加入培养液中，目的在于研究2 种中药对早期胚胎体外发育的效果，结果表明中药组的胚胎发育率高于空白对照组。与之前报道显示在培养液中添加中药促进胚胎体外发育基本相符［16］。但本试验中肉苁蓉对胚胎体外发育有极显著影响，可能是其有效成分直接或间接对胚胎发育微环境有更好的调节作用，但具体机理还需进一步研究。中药具有安全、低毒等特性，本试验发现中药添加浓度对胚胎体外发育也有较大影响，试验中发现添加合适浓度的中药能促进胚胎体外发育，可能是中药的某些有效成分同样能起到清除体外环境中毒性物质的功效，但其具体影响机理还需进一步研究。添加高浓度中药及高浓度组合中药时对胚胎发育产生副作用，故在临床医学上重要启示，注意用药量的控制来确保用药安全性，这也符合基本用药要求。同时，本实验对无菌环境要求较高，这对实验结果影响也较大。

3． 3 在理论和生产中应用前景

本试验初步研究了2 种滋阴壮阳类中药对早期胚胎发育的影响，在前人的研究理论基础上创新性研究了2 种中药的全药特性，不局限于某单一有效成分上，同时对2 种中药的组合特性和功能进行了研究，丰富了传统中医用药理论，同时，在生产实践应用也有较大的意义，既能提高动物胚胎的体外发育率，最终体现在获得更高的产仔率，也对2 种中药能更好造福于人类具有一定价值和意义。

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