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［摘 要］ 从野生肉苁蓉的茎中分离出水溶性粗多糖．粗多糖经Sevage 法脱蛋白、反复冻融、高速离心、超滤分级得级分SPA．经高压液相色谱等方法证明SPA 为均一组分气相色谱分析SPA 的单糖组成为AraRhaManGalGlc摩尔比依次为1．83∶1．00∶3．06∶4．56∶14．74．以上结果表明多糖SPA 是以葡萄糖和半乳糖为主兼有阿拉伯糖、鼠李糖和甘露糖的中性杂多糖．
［关键词］ 肉苁蓉；多糖；组成
0 前言
肉苁蓉（Cistanche deserticola Ma）为列当科肉苁蓉属多年生草本植物专性寄生于沙漠戈壁植物梭梭的侧根部为国家二级重点保护植物．其肉质茎可入药药性为：补精血、益肾强筋、润五脏、暖腰膝治虚劳内伤［1］被誉为“沙漠人参”．目前国内外对肉苁蓉的研究表明其主要的药理活性成分为多糖和苯乙醇苷肉苁蓉多糖的药理活性主要有抗衰老、调节免疫、促进创伤愈合、抗氧化、强体、保肝健脾等作用［2］．目前分离到的肉苁蓉多糖大多都是一些杂多糖加之生境、培养条件、提取分离技术的不同造成多糖结构及活性出现差异这些都给进一步研究带来了困难在分子水平上阐明它们的药理作用和作用机理受到了很大的限制．虽然有不少肉苁蓉多糖已应用临床但由于其化学结构不明确质量很难控制造成药物重复性较差不符合国际规范因而也难以在医药领域占主导地位．有关肉苁蓉多糖进一步分离纯化的研究较少且不全面［3］所以本文拟对其进行较细致的研究以求确定是哪一种多糖在药理上发挥主要作用．
1 材料仪器与试剂
1∙1 材料
肉苁蓉（Cistanche deserticola Ma）购于吉林省长春市吉林大药房东北师范大学生命科学学院植物教研室鉴定．
1∙2 仪器与试剂
2300全自动凯氏定氮仪Ⅱ（丹麦FOSS 公司）ALPHA1－2型号冻干机（德国）SHIMADZU高压液相色谱（日本岛津）WZZ－T1 型旋光仪（上海物理光学仪器厂出品）Vavian3400气相色谱仪（美国附FID 检测器）．
右旋糖酐为中国药品生物制品检定所生产Sephadex G－75及Sephadex G－100均为Pharmacia 产品三甲基氯硅烷为Flukache mika 产品六甲基二硅胺烷为上海试剂一厂产品其余试剂均为分析纯．
2 实验方法
2∙1 粗多糖的提取与分离
将切成薄片的肉苁蓉茎置于2∙5倍体积的蒸馏水中浸泡24h 后小火煮提4次每次2h合并滤液并浓缩至挂壁．加入3倍体积的84％乙醇醇析24h离心后得粗多糖SP．
2∙2 蛋白含量测定（凯氏定氮法）
取粗糖700mg硝化后进样蒸馏时间3∙5min循环时间4．5min测定范围0．1～200mg重现性1％回收率99．5％～100％．
2．3 粗多糖的纯化分级
2．3．1 反复冻融
将粗多糖SP 用蒸馏水配成5％的溶液－20℃冷冻室温缓慢融化高速离心（8000
r／min）重复三次．
2．3．2 脱蛋白
将英国进口链蛋白酶按w 酶∶w 蛋白＝1∶50加至5％的糖溶液中同时加入少量二甲苯防腐（1％NaCl 作激活剂）37℃保温48 h．按糖液总体积的1／4加入Sevage 试剂（V 氯仿∶V 正丁醇＝4∶1）充分振荡1～2h静止离心取上清重复至无游离蛋白为止［4］．
2．3．3 超滤分级
将糖液配成2％的溶液分别过膜进行超滤压力为68．9kPa时间为1h．将糖液冻干后取相对分子质量为5000～10000之间的多糖做进一步的分级［5］．
2．3．4 Sephadex G－75柱层析分级
将相对分子质量为5000～10000之间的多糖配成100％的溶液上Sephadex G－75（2．5cm×90cm）制备柱0．9％NaCl 洗脱流速0．5mL／min得级分SPA．
2．4 SPA 纯度鉴定
2．4．1 高压液相色谱
层析柱：G3000PWXL；流动相：0．9％NaCl；流速：0．5mL／min；柱温：40℃；压力：2．0MPa；进样量：20μL．
2．4．2 醋酸纤维薄膜电泳
醋酸纤维薄膜电泳2cm×8cm缓冲液为硼砂－NaOH（pH＝10）甲苯胺蓝染色90％乙醇作漂洗液无水乙醇和冰醋酸（ V 无水乙醇∶V 冰醋酸＝3∶1）作透明液电压40V电泳时间50min．
2．5 SPA 的有关性质测定
2．5．1 总糖含量测定（酚－硫酸法）
将0∙1mg／mL 糖溶液、6％苯酚溶液、浓硫酸依次按1∶0．5∶2．5的体积比加入振荡静止冷却然后在490nm 波长下比色所得数值查标准曲线可得总糖含量［6］．
2．5．2 相对分子质量测定
采用G3000PWXL高压液相层析柱0．9％的NaCl 为流动相示差检测器检测以中国药品生物制品检定所生产的右旋糖酐（相对分子质量分别为2．14×1041．0×1040．71×1040．46×1040．25×104）制成标准曲线测定SPA 的相对分子质量．
2．5．3 红外光谱检测
采用SPECORD IR 型红外光谱仪样品与KBr 压片扫描范围4000～400cm－1常规方法测定．
2．5．4 比旋光度测定
将10mL 饱和糖液用自动旋光仪钠灯光源蒸馏水调零点1dm 管室温下测定［7］．
2．6 气相色谱分析（G．C．）
2．6．1 甲醇解
彻底干燥的糖样10mg加入无水HCI－甲醇2mL充氮气封管80℃甲醇解20h凉至室温后用无水KOH－甲醇中和至pH＝640℃减压旋转蒸干常规干燥［8］．
2．6．2 硅烷化（T．M．S 衍生物制备）
向彻底干燥的甲醇解产物中加入0．2mL 无水吡啶（内含饱和甘露醇作内标）；75℃溶解30min然后加入0．3mL 硅烷化试剂（V 六甲基二硅胺烷∶V 三甲基氯硅烷＝2∶1）摇匀静止几分钟即可取上清进行分析．
2．6．3 气相色谱条件
色谱柱：SE－30（50mm×0．2mm×0．25μm）；气化：300℃；检测：300℃；柱温：120℃（2min）→250℃（30min）；载气：高纯氮气．
3 结果与讨论
粗多糖SP（常规干燥样品）的收率为5％为棕褐色粉末易溶于水酚－硫酸法测得总糖含量为49％用凯氏定氮仪测其蛋白含量为10．69％经P．C．和G．C．分析其组成为RhaAraManGalGlc摩尔比依次为3．46∶1．00∶2．58∶2．98∶7．33为中性杂多糖．粗多糖在Sephadex G－100柱层析中峰形分布宽且不对称为不均一组分需进一步分级、纯化．
粗多糖反复冻融3次高速离心取上清液冻干经酶法和Sevag 法联合脱蛋白41次后再经超滤分级发现相对分子质量在5000～10000之间的级分收率最好为30．1％且相对分子质量分布范围较窄故选其为进一步分级的对象．将所得级分经Sephadex G－75制备柱制备得级分SPA．经高压液相色谱检测SPA 呈单一狭窄对称峰（见图1）醋酸纤维薄膜电泳检测呈单一谱带在不同浓度的低醇溶液中SPA 的比旋光度基本一致由此可见SPA 为纯度较好的多糖样品．SPA（冻干样品）为灰白色粉末易溶于水旋光值为［α］20D ＝＋288°相对分子质量为7600．红外光谱分析表明它在890cm－1处有特征吸取峰说明SPA 主要由β－糖苷键构成在3600～3200cm－1的吸收峰是－OH 的吸收峰在2922cm－1左右有一强的吸收峰是－CH 和－CH2 的共振吸收峰1671cm－1左右的峰是多糖的水合振动峰（见图2）．经酚－硫酸法测定查标准曲线它的糖含量为95％．经G．C．分析其单糖组成为AraRhaManGalGlc摩尔比依次为1．83∶1．00∶3．06∶4．56∶14．74．
多糖药物的研制已成为当今世界新药的发展方向之一．多糖具有多种生物活性是理想的免疫增强剂随着中国加入WTO 和中药现代化的要求祖传秘方已经不被人们所信服要想将中药打入国际市场就必须弄清其有效成分是什么其结构如何、比例怎样将中药现代化的口号打响．应利用我国现有的化学、物理和生物学等分析技术对肉苁蓉多糖的分子结构进行深入研究在此基础上探讨肉苁蓉多糖的构效关系、量效关系及肉苁蓉多糖免疫作用机理加强肉苁蓉多糖的制备、质量标准、给药途径等技术问题的研究为肉苁蓉多糖的合成、药理学及临床学的研究打下坚实的理论基础以不断扩大肉苁蓉多糖在临床领域的应用．肉苁蓉多糖SPA 相对分子质量较小且水溶性好与已知的天然活性多糖有许多相似之处所以有必要对SPA 继续进行深入研究目前SPA 的结构研究正在进行中．
［参 考 文 献］
［1］ 樊文颖．肉苁蓉开发利用研究的进展与问题［J］．内蒙古林业调查设计200124（4）：46～47．
［2］ 曾群力郑一凡吕志良．肉苁蓉多糖的免疫活性作用及机制［J］．浙江大学学报200231（4）：284～287．
［3］ 曾群力霍亚楠毛俊浩等．肉苁蓉多糖的分离、纯化和鉴定［J］．中草药200233（12）：1057～1058．
［4］ 梁忠岩张翼伸．斜订菌中水溶性多糖的研究［J］．高等学校化学学报19834（3）：364～370．
［5］ 张维杰．糖复合物生化研究技术［M］．杭州：浙江大学出版社1999．94．
［6］ Sana S KBre wer C F．Deter mination of the concentrations of oligosaccharidescomplex type carbohy dratesandglycoproteins using the phenol－sulfuris acidt method［J］．Carbohydr Res1994254：157～167．
［7］ 陈玉香张丽萍梁忠岩等．沙棘果水溶性多糖H2 的分离纯化与抗病毒研究［J］．东北师大学报（自然科学版）1997（4）：74～77．
［8］ 石德成张翼伸．碳水化合物的气相色谱分析［J］．东北师大学报（自然科学版）1982（3）：43～49．
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