徐辉，魏晓东欧芹，张鹏霞，白大芳，王明富，杨 晶，李志伟

（佳木斯大学基础医学院生化教研宝，黑龙江佳木斯154007）

摘要：目的：观察肉苁蒙水提液对D-半乳糖致表大鼠肝脏氧化损伤的保护作用。方法：采用D-半乳糖所致表老模型大鼠，灌服内苁蓉水提液6周，测定肝脏活性氧单位Ca-ATP酶活性，肝线粒体 MDA含量、PLA2活性。结果：肉苁蓉水提液显著提高衰老模型大鼠肝脏活性氧单位C2-ATP酶活性（P＜001）．显著降低肝线粒体 MDA含量、PLA2活性（P＜0.01）结论：内苁蓉水提液能提高衰老模型大鼠肝脏抗氧化能力，具有抗表老作用。

关键词：内苁蓉；致表大鼠；肝脏；氧化损伤：线粒体

中图分类号：R965.1；R285.5 文献标识码：A 文章编号：1008-0104（2004）05-0022-02

肉苁蓉为列当科植物.肉苁蓉（Gstanyhe deseticola Y CMa）的干燥带鳞片的肉质茎，主产于我国的内蒙古、新疆、甘肃、青海、陕西等省区，具有补肾阳、益精血，润肠通便等功效 有研究表明，肉苁蓉具有增强免疫力、抗辐射、抗疲劳等药理作用。但有关肉苁蓉水提液对 D-半乳糖致衰大鼠肝脏活性氧单位、C2-ATP酶活性以及肝线粒体 MDA含量PLA活性的影响未见报道本实验通过肉苁蓉水提液对致衰大鼠肝脏氧化损伤保护作用的研究，以期进一步探讨肉苁蓉的抗氧化作用和抗衰老机制

1 材料与方法

1.1 材料

动物：纯系 Wistar大鼠30只，3-4月龄，体重180-210g，雌雄各半，由黑龙江省佳木斯大学实验动物中心提供药材：肉苁蓉，由佳木斯药材公司提供 主要仪器：赛多利斯PP-25型高灵敏度 pH计：TDZ5-WS多管架自动平衡离心机：GL-21M高速冷冻离心机；722光栅分光光度计：DY89-1 型电动玻璃匀浆机；KQ-5200型超声波清洗器：电热恒温箱等，主要试剂：去氧胆酸钠由 Amence公司提供；MDA试剂盒，活性氧试剂盒，C-ATP酶试剂盒，考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，双缩脲蛋白测定试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；D-半乳糖（D-gal）由上海试剂二厂提供

1.2 实验方法

1.21 药剂制备

取肉苁蓉400g用水浸泡30min，超声提取两次，每次30min，抽滤器抽滤后，合井滤液井浓缩至相当于每毫升含生药0.5g后得肉苁蓉水提液，贮存备用。

1．．2 动物分组、给药及处理

将30只大鼠随机分为3组：青年对照组，衰老模型组。模型给药组，每组各 10只，常规饲料喂养，青年对照组每日上午皮下注射生理盐水，灌服温开水；衰老模型组每日上午按50mg／kg剂量皮下注射 D-gal．同时灌服温开水；模型给药组每日上午按 S0mg／kg剂量皮下注射 D-gal．同时按生

药量2g／kg灌服肉苁蓉水提液。连续给药 6周后，处死动物，取材

1.2.3 肝匀浆及肝线粒体制备

参照南京建成生物工程研究所提供的实验方法学，取肝脏1g左右，用冷生理盐水漂洗，拭干称重，加入 9倍体积预冷的匀浆介质，用电动匀浆机充分磨碎得肝组织匀浆，将肝组织匀浆（3000r／min）离心 10min，取上清冻存待测 按上述方法制备肝匀浆，取肝匀浆（2000／min）离心10min，弃沉淀，上清液（10000r／min）在高速冷冻离心机中离心15min，沉淀物即为线粒体，将线粒体悬浮于介质中，供指标测定

1.2.4 指标测定

肝组织活性氧单位，G-ATP酶活性，肝线粒体丙二醛（MDA）含量测定按试剂盒说明进行，其中活性氧单位定义为每毫克组织蛋白在3C下反应1min，使反应体系中HO2降低1mmol／L为一个活性氧单位，活性氧单位越高，抗氧化能力越强C2-ATP酶活性定义为每小时每毫克组织蛋白的 ATP酶分解 ATP产生 μmol无机磷的量为一个ATP酶活力单位。磷脂酶 A活性测定参照陈思锋方法进行四，取2只 25ml烧杯分别作为测定管和对照管，测定管中加入底物缓冲液 8ml．0 5mol／L氯化钙0.2ml．样本 04ml：对照管中加入底物缓冲液 8ml．15mmol／L EDTA1.1mL样本0.4ml然后 37C水洛 60min再向测定管中加入 1.1mlEDTA．对照管中加入0.2ml氯化钙，混匀后用赛多利斯 PP-25型高灵敏度pH计分别测定两管的pH．用新标定的0.002mol／1腾盐酸将对照管的pH滴定至测定管的pH值，以所消耗的盐酸计算测定管中酶的活力。

1.3 统计学分析

实验数据以均数土标准差（x士s）表示，应用 SPSS11．统计学软件进行统计学分析。

2 结果

肉苁蓉水提液显著提高衰老模型大鼠肝脏活性氧单位。C-ATP酶活性（P＜0.01），显著降低肝线粒体 MDA含量、PLA活性（P＜0.01），见附表

附表 肉苁蓉水提液对衰老模型大鼠肝脏活性氧单位.Ca-ATP酶活性。

肝线粒体丙二醛（MDA）含量，PLA2活性的影响（x±s）

注 与青年对照组比较ΔP＜0.01，与衰老模型组比较＊P＜0.01

3 讨论

许多实验证据表明，D-半乳糖衰老模型大鼠出现一系细胞器，在线粒体产生能量的同时，有2％的氧在线粒体内转化为氧自由基，由于机体内存在抗氧化剂，使活性氧等氧自由共的生和造验保持平密团多这融平衡被破坏时 就金

使自由基生成过多，导致机体出现衰老的改变实验表明，衰老时细胞内尤其是线粒体 SOD活性下降，MDA含量增加本实验以D-半乳糖衰老模型大鼠为研究对象，结果表明，衰老大鼠肝组织活性氧单位（抗氧化能力）较青年鼠显著下降，肝线粒体丙二醛（MDA）含量显著上升，这说明，衰老时抗氧化剂清除率的下降，使机体抗氧化能力下降，进使活性氧等自由基的产生和清除失去平衡，于是活性氧在机体内堆积。损伤细胞 由于线粒体膜直接接触活性氧，受到直接攻击，使膜脂质氧化形成大量过氧化脂质及丙二醛，同时由于线粒体膜氧化受损，使活性氧外漏而损伤细胞器，造成细胞功能的下降，本实验证明，衰老大鼠肝组织C2-ATP酶活性的下降可能也是由于氧自由基从线粒体漏出后损伤细胞膜而导致的结果

磷脂酶A（PLA）位于线粒体内外膜之间，与内外膜紧密结合，属于 PLA-11型（膜结合型），是磷脂Sn-2位酰基水解酶的简称，相对分子质量约为14000．C2为其激活剂问 大量实验证据表明，衰老时出现细胞内钙稳态失调和细胞钙调节能力减低，细胞膜钙泵活性随年龄增加而显著下降，外排C的能力明显降低，结果导致细胞内游离钙增加。钙稳态失调 钙超载时对细胞造成的损伤主要有两方面：①使线粒体氧化磷酸化解偶联，细胞呼吸抑制，②激活磷脂酶GAA3本实验证实，衰老大鼠肝组织C2-ATP酶活性下降，肝线粒体 PLA2活性升高，说明可能由于C2-ATP酶活性的下降使胞浆C浓度升高，导致线粒体 PLA活性的升高。PLA是许多生化过程的关键酶，它可以水解自身磷脂使线粒体膜骨架脆性增加，花生四烯酸释放增加，同时产生大量自由基，导致膜通透性增加，钙离子大量流入，钙离子进一步激活 PLA从而造成恶性循环、此外，PLA活性的升高可以改变膜磷脂的成分，对膜流动性产生影响，同时，PLA降解磷脂的产物也会损害呼吸链，影响氧化磷酸化并造成线粒体不可逆损伤！PLA2还可以直接造成质子跨线粒体内膜转运能力下降及 H-ATP酶活性下降可见，PLA会从不同方面造成线粒体功能下降进而影响机体正常功能

本实验结果显示，肉苁蓉水提液可提高肝脏抗氧化能力C2-ATP酶活性，降低肝线粒体MDA含量，PLA活性。这可能是由于肉苁蓉具有抗氧化功能，使自由基生成减少，从面减轻自由基对肝组织及线粒体的损伤作用，进而提高肝脏抗氧化能力，减少脂质过氧化，也使 Ca-ATP酶免受损伤，保证了C2-ATP酶的活性，使肝细胞内外钙离子浓度保持正常水平，避免由于胞内钙超载而导致线粒体PL．A2活性的升高本实验表明，肉苁蓉水提液通过提高肝脏抗氧化作用，减少脂质过氧化产物，减轻线粒体氧化损伤起到抗衰老作用

参考文献：

1陈思锋，吴中立，体液和组织磷脂酶 简便快速测定法［J］第二军医大学学报，1989.10（3）254-256

12陈熙，李文彬，张炳烈，D-半乳糖亚急性中毒大鼠拟衰老生化改变｜川中国药理学与毒理学杂志，1990.4（4）：309-310

3]lnone M,Sate EF,Nishikawa M,et al Mitochondrial genera-tion of reactiw e asygenspecies and is role in aerobie bfe Jl.Curr Med Chem,2003.10(23):2495-2505

[4]Harman D.The fee radeal theory of aging[JAntiosid Redex Signal 2003.5(5):557-561

[5]Vohra BP.Sharma SP,Kanal VK.Age- depe nde at variations in mitochond rial and eytosolie antioxilant enzymes and lipil per-exidation in dffere at regions of central nevous sysem of gna Pigs[ J} Indian JBochem Beplays.2001,38(5):321-326

［6顾天爵．生物化学［M］．第4版，北京：人民卫生出版社，2000.115-116

（7］狄荣料，马瑞，周志强，等，褪黑激素对中老年大鼠抗氧化作用的初步观察［月中国老年学杂志，2000.20（4）：232-233

[8]Bordorf G.Uemura Y,Banventre JN.Characterization of phm-pholipame Az( PL Ae) activity in gerbil brais enhanced activties of eyteseke,mitochondrial.and microsomal brms dter ischemia and reperfsion[J] J Nerosci 1991.11(6)1829-1836

19課晚益，黄跃生，杨宗城，严重烧伤早期心肌线粒体磷脂变化及其机制［J月中华创伤杂志，2001.17（7）：416-419

［10陆松敏，杨鹤鸣，宋双明，等，LPS PLA2及氧自由基对线粒体跨膜质子转运和 H-ATPase的影响［J］第三军医大学学报，1998.20(4)329-332

（收稿日期：2004-09-13）