肉苁蓉为稀有的名贵中药材, 具有补肾~ 益精~ 润肠及抗衰老等功效[1]. 研究表明, 肉苁蓉多糖具有延缓皮肤衰老~ 增强机体免疫功能~ 促进人体外成纤维细胞的生长及促进创伤愈合[2]等生理活性作用. 对于肉苁蓉多糖的深入研究尚未见报道, 为探讨多糖的生物活性与结构的关系, 本文对肉苁蓉茎水溶性多糖SPA 组分进行结构分析. 有关肉苁蓉茎水溶性多糖SPA 组分的分离纯化过程见文献[3].

1 实验部分

1. 1 试剂与仪器Sephadex G-75( Pharmacia 公司) ; 二甲基亚砜( 江苏洪声化工厂) ; ShimadZu 高压液相色谱( 日本岛津) ; Vavian 3400 气相色谱仪( 附FID 检测器, 美国惠普) ; HP 5988A GC/MS四级杆质谱( 美国惠普) ; Ac-80 MHZ 脉冲傅里叶变换核磁共振波谱仪( 瑞士Bruker) .

1. 2 SPA 部分酸水解按文献[4]方法进行, 取100 mg 糖样溶于2 mL 蒸馏水中, 加入2 mL0. 1 mO1/L三氟乙酸, 于80 C 水解1 h. 离心, 对沉淀进行GC 分析, 在上清液中加入3 倍体积的无水乙醇醇析过夜. 离心后将沉淀中的一部分作GC 分析, 另一部分作高碘酸氧化, 剩余部分用蒸发皿赶出三氟乙酸( 加无水乙醇) 后作GC 分析.

1. 3 SPA 高碘酸氧化及Smith 降解按文献[5]方法进行, 以0. 15 mO1/L 高碘酸钠对SPA 的部分酸水解沉淀进行氧化, 间隔一段时间取样, 用紫外分光光度计在223 nm 处监测高碘酸消耗量. 反应60 h后, 高碘酸消耗量达到一恒定值, 加乙二醇终止反应, 透析后浓缩, 加入过量的KBH4还原过夜. 用50%的HAc 中和至中性, 透析后取1/ 3 干燥, 用作GC 分析, 在剩余部分中加入1 mO1/L H2SO4 , 于25 C 水解40 h 后, 用BaCO3中和至pH= 6, 过滤后, 滤液用蒸馏水透析48 h, 袋外部分经干燥后用作GC 分析, 袋内部分用于乙醇醇析, 上清液及沉淀经干燥后用作GC 分析.

1. 4 SPA 甲基化分析按文献[6, 7]方法进行, 在充分干燥的20 mg 样品中, 加入6 mL 以4 目分子筛脱水的二甲基亚砜, 充入N2气, 密封后于40 C 下磁力搅拌至均匀为止, 加入6 mL NaOH-DMSO混悬液和3. 6 mL 碘甲烷, 密封, 磁力搅拌7 min 后, 加入6 mL 蒸馏水中止反应, 装入透析袋内, 经流水~ 蒸馏水各透析24 h, 并以氯仿萃取3 次后, 再用蒸馏水反复洗涤3 次, 无水硫酸钠干燥24 h 后,蒸除氯仿至1 mL 左右, 用IR 检查至3 400 cm-1处无 OH 吸收峰.

向甲基化多糖中加入85%的HCOOH, 充N2气封管, 于100 C 水解4 h 后, 以CH3OH 除去HCOOH; 经真空干燥后, 再加入2 mL 2 mO1/L 三氟乙酸, 于100 C 下水解6 h, 用无水乙醇除去三氟乙酸, 再用蒸馏水除去乙醇; 加入KBH4

搅拌过夜还原, 以阳离子交换树脂处理后, 用CH3OH 蒸除H2BO4 , 加入乙酐和无水吡啶各0. 5 mL, 封管, 于100 C 乙酰化2 h, 再加无水乙醇除去乙酐, 干燥后用氯仿溶解进行GC/MS 分析. GC/MS 采用毛细管OV 101( 25 m> 0. 2 pm) 玻璃柱测定, 气化温度300 C , 柱温100 C , 检测温度300 C , 并按该仪器所附数据库检索定性.

1. 5 气相色谱的测定参照文献[8]方法进行 采用Vavian 3400 气相色谱仪 附FID 检测器 SE-30型色谱柱( 50 m> 0. 22 mm> 0. 25 Mm) 初始柱温120 保持2 min 后以8 /min 的速度程序升温至250 保持30 min 以高纯 2气为载气 气化温度300 检测温度300 .

1. 6 红外光谱及核磁共振测定Specord IR 型红外光谱仪 KBr 压片 扫描范围4 000*400 cm-1 .核磁共振测定参照文献[9 10]方法进行 13C MR 频率25 M~Z 室温 宽带噪音去偶 累加49 439次 糖样30 mg 5 mm 13C 双碳头.

2 结果与分析

2. 1 部分酸水解产物分析SPA 经部分酸水解结果见表1 用GC 检出大量Glc 及少量Gal 和Man说明主链主要由Glc 构成; 袋外部分检出各种单糖的比例显示 Ara 较部分酸水解前明显增加 推测其可能存在于末端结构中.

2. 2 SPA 高碘酸氧化及Smith 降解产物分析在SPA 的高碘酸氧化过程中 平均每摩尔己糖残基释放出0. 648 mol 甲酸 说明平均每20 个己糖残基中 有13 个非还原性末端或1-6 糖苷键; 因高碘酸的消耗量多于甲酸生成量的2 倍 说明存在一些可被高碘酸氧化但不释放甲酸的1-4 1-4 6 1-2 及1-2 6 键.Smith 降解结果见表2 降解后产生大量的甘油和赤藓醇 说明SPA 中存在大量的1- 1-21-6 1-2 6 1-4 及1-4 6 中的某些键型; 检出Gal 与Glc 说明 二者存在不被高碘酸氧化的1-3 1-2 3 及1-3 6 键型; 袋外部分检出少量的Gal 和Glc 说明不被高碘酸氧化的Gal 与Glc 或者位于末端及边缘 或者与可被氧化的糖毗邻.

2. 3 SPA 甲基化产物分析SPA 经甲基化 水解 还原及乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯 对其进行GC 和GC/MS 联机分析 其结果见表3. 表明Ara 为末端基 ( 1-6)Glc 在多糖中的含量最多 同时还有一部分( 1-3 6)Glc Gal 及Man 均以1-4 键连接为主 Gal 存在少量的1-3 键 Rha 则以1-2键连接.

2. 4 SPA 的红外光谱及13C MR 分析SPA 的红外光谱图在1 625 cm-1处显示有多糖的特征吸收峰 在890 cm-1处的吸收峰为 构型糖苷键的特征吸收峰. SPA 的13C MR 图谱在异头碳 99*110共振范围内有102. 58 和100. 64 两个比较明显的共振信号 表明此多糖的糖苷键为 构型; 另外SPA 的化学位移与相同条件下标准图谱中 ( 1-6)Glc 及 ( 1-4)Gal 的化学位移相似 且从峰高度判断 ( 1-6)Glc 残基的比例明显多于 ( 1-4)Gal 残基的比例.综合部分酸水解 高碘酸氧化 Smith 降解及GC 甲基化 红外光谱及13C MR 分析等各种实验手段的结果 SPA 结构中主要为 构型糖苷键 由( 1-6)Glc 构成主链 侧链由( 1-4) Gal ( 1-4)Man ( 1-3)Gal 和( 1-2) Rha 片段组成 分子中每24 个糖残基为一个重复单位 主干为14 个糖残基 平均每7 个( 1-6)Glc 在3-0 处有一个分枝[一个侧链由1 个( 1-3)Gal 和3 个( 1-4)Man 组成另一个侧链由3 个( 1-4)Gal 和一个( 1-2)Rha 组成] 末端残基为Ara 结构式如下:

参考文献

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