摘要: 目的研究复合酶提取肉苁蓉的工艺; 比较传统水提、醇提与酶解后水提、醇提，正丁醇萃取物抗氧化活性。方法以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作为评价指标，选择酶用量、酶解温度、酶解时间为主要因素，通过正交试

验确定复合酶提取肉苁蓉的最佳工艺条件，并在此基础上，比较不同提取方法下提取物抗氧化活性。结果复合酶强化提取肉苁蓉最佳工艺参数为复合酶0. 2%、酶解温度60 ℃，酶解时间2. 5 h; 等量药材同体积肉苁蓉提取液，抗氧化活性依次为: 酶解后醇提﹥酶解后水提﹥传统醇提﹥传统水提。结论在所得的复合酶提取肉苁蓉工艺条件下，肉苁蓉抗氧化活性可以显著提高。

关键词: 肉苁蓉; 复合酶; 提取工艺; 抗氧化活性

肉苁蓉Cistanche deserticola YC． Ma 是我国传统名贵中药材，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效［1］。当前，评价肉苁蓉质量主要是对《中国药典》规定的指标成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的量进行检定，近代药理学研究也表明，该药材中的松果菊苷和毛蕊花糖苷能提高机体免疫功能，促进DNA 合成，增强体力，提高智能，具有明显的抗衰老作用［2-3］。自由基具有高度的化学反应活性，其过多或清除过慢，都会加速机体衰老，并且会诱发多种疾病［4］。铁氰化钾法总还原力测定、DPPH·( 二苯代苦味酰自由基) 分析法被广泛用于抗氧化活性研究，是用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速、简便、灵敏可行的方法［5］。

酶技术是近年来用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术。通过选用一些恰当的酶类，使细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶等物质降解，引起细胞壁及细胞间质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减

小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从传质角度促使有效成分提取率提高［6］。为了更好地开发利用这一珍贵的资源，本实验在纤维素酶提取肉苁蓉中苯乙醇苷［7］、果胶酶酶解研究基础上，将纤维素酶与果胶酶按一定比例混合制成复合酶，并对复合酶提取肉苁蓉工艺进行优选，在酶解强化提取基础上，将传统水提、醇提及酶解强化水提、醇提进行了抗氧化活性研究，以便为肉苁蓉科学生产合理应用提供理论依据。

1 仪器与试药

肉苁蓉购于甘肃省安宁医药公司，经甘肃中医学院鉴定教研室杨扶德老师鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY． C． Ma 的干燥带鳞叶的肉质茎。松果菊苷对照品( 购于中国食品药品检定研究院，批号111670-200503) ;毛蕊花糖苷对照品( 购于中国食品药品检定研究院，批号111530-200303) ; 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼( 纯度＞ 96%，Sigma 公司) ; 正丁醇( 分析纯) ; 甲醇、乙腈、醋酸( 色谱纯) ; 95%乙醇( 色谱纯) ; 纤维素酶、果胶酶均购于宁夏和氏壁生物技术有限公司。Waters 高效液相色谱仪( 美国，1525 型输液泵，2487型紫外检测器，2996 型检测器，717 自动进样器，watertsEmpower 色谱软件) ; UV1800PC 型紫外分光光度计;FA1604s 电子天平; DD-5M 型湘液离心机; DZF-6051 型空干燥箱。

2 实验方法

2. 1 提取物测定

2. 1. 1 色谱条件检测波长为334 nm; 流动相为乙腈-甲醇-1%醋酸( 10 ∶ 15 ∶ 75) ，体积流量1 mL/min，等度洗脱; Agilent HC-C18色谱柱( 5 μm，4. 6 mm × 250 mm) 。

2. 1. 2 对照品溶液制备精密称取松果菊苷10. 00 mg，毛蕊花糖苷10. 00 mg，用流动相定容至50 mL，作为对照品贮备液。

2. 1. 3 供试品溶液制备取20 g 肉苁蓉药材，精密称定，浸泡一定时间，加8 倍量水煎煮2 次，每次2 h，合并煎液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得

浸膏，转移至50 mL 量瓶中，加流动相至刻度，贮备待用。

2. 1. 4 线性关系考察分别将松果菊苷、毛蕊花糖苷贮备液移取2 mL 至10 mL 量瓶中，用流动相定容，作为对照品使用。分别进样1、2、4、8、10、20 μL，将进样量X( μg) 和峰面积Y 做线形回归。结果松果菊苷标准曲线回

归方程为Y = 6. 89 × 105X － 6. 67 × 104 ，r = 0. 999 9; 毛蕊花糖苷标准曲线回归方程为Y = 5. 74 × 105X － 6. 69 × 104 ，r =0. 999 9。表明松果菊苷和毛蕊花糖苷均在0. 2 ～ 14. 0 μg 范围内呈良好线性关系。

2. 1. 5 精密度考察同一供试品溶液，连续进样5 次，测得松果菊苷峰面积的ＲSD 为1. 6%，毛蕊花糖苷的ＲSD为1. 8%。

2. 1. 6 重复性试验取同一批供试品溶液，按“2. 1. 3”项下方法制备5 份溶液，以上述色谱条件测定，松果菊苷峰面积的ＲSD 为1. 3%，毛蕊花糖苷峰面积的ＲSD为1. 9%。

2. 1. 7 加样回收率试验取6 个25 mL 量瓶，从用酶解强化水提的肉苁蓉样品液中吸取1. 00、2. 00、3. 00 mL 于前3 个量瓶中，后3 个量瓶中加入同样多的样品液，然后分别精密加入相应的对照品溶液，各份均按上述测定方法进行测定，测得松果菊苷和毛蕊花糖苷的加样回收率分别为98. 9%和97. 8%，ＲSD 分别为1. 9%和1. 8%。

2. 1. 8 样品测定分别称取肉苁蓉药材粉末20 g，按“2. 1. 3”项下方法制备供试品溶液，测定对照品及供试品，结果见图1、图2。

2. 2 复合酶提取正交试验方案在单因素试验基础上，发现纤维素酶用量在0. 1%，果胶酶用量在0. 15% 时对肉苁蓉提取影响较为显著( 另文发表) ，故为简化实验过程，在正交优化试验过程中，按照复合酶( 纤维素酶∶ 果胶酶= 2 ∶ 3) 配比，并按表1 设计选择不同酶用量、酶解时间、酶解温度进行酶解，酶解后水提2 次，每次2 h，提取液浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，完全转移至50 mL 量瓶中，加流动相至刻度，按正交试验要求共得到9 份样品液，分别用0. 45 μm 微孔滤膜滤过定容至10 mL 量瓶，标注为样品液1 ～ 9 号，测定各样品中松果菊苷和毛蕊花糖苷的量，计算其提取率。正交试验设计见表1。

2. 3 提取物的抗氧化活性测定方法

2. 3. 1 总还原力测定( 铁氰化钾法［8］) 取试样2 mL，加2. 5 mL pH 6. 6 磷酸缓冲溶液、2. 5 mL 1% 铁氰化钾，混合物在50 ℃恒温条件下，加热20 min。急速冷却，加2. 5 mL10% 三氯乙酸，混匀后以3 000 r /min 离心10 min。取上层清液2. 5 mL，加2. 5 mL 蒸馏水再加0. 5 mL 0. 1%FeCl3，混合均匀，静置10 min 后，在700 nm 处测定吸光度。

2. 3. 2 提取物DPPH·清除活性测定［ 5］ 精密称取DPPH4. 4 mg 用95%乙醇溶解并定容至100 mL，得DPPH 溶液。取试样2 mL 加DPPH 溶液2 mL，在室温下反应30 min 后于517 nm 处测定吸光度( Ai) ; 同时测定DPPH 乙醇溶液2mL 和95%乙醇2 mL 的吸光度( AO) 及各样品液2 mL 分别加95%乙醇2 mL 的吸光度( Aj) 。各吸光度值平行测定3 次，取其平均值。按下式计算DPPH·清除率。DPPH·清除率( %) = ［1 － ( Ai-Aj) /AO］ × 100

3 不同提取方法抗氧化活性

3. 1 酶解强化水提准确称取20 g 肉苁蓉药材，浸泡一定时间，按已优化复合酶酶解工艺酶解，药渣加8 倍量水煎煮2 次，每次2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至50 mL 量瓶中，加95%乙醇至刻度，再分别移取上述溶液1. 00、2. 00、4. 00、6. 00、8. 00 mL 置于25 mL 量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度( 换算成生药材质量浓度分别为0. 016、0. 032、0. 064、0. 096、0. 128 g /mL) 的溶液，按照总还原力测定、DPPH·方法测定。

3. 2 酶解强化醇提准确称取20 g 肉苁蓉药材，浸泡一定时间，按已优选复合酶酶解工艺酶解，药渣加8 倍量75%乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至50mL 量瓶中，加95% 乙醇至刻度，再分别移取上述溶液1. 00、2. 00、4. 00、6. 00、8. 00 mL 置于25 mL 量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度( 换算成生药材质量浓度分别为0. 016、0. 032、0. 064、0. 096、0. 128 g /mL) 的溶液，按照总还原力测定、DPPH·方法测定。

3. 3 传统水提准确称取20 g 肉苁蓉药材，浸泡一定时间，滤过，药渣加8 倍量水煎煮2 次，每次2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥去溶剂得浸膏，转移至50 mL 量瓶中，加95% 乙醇至刻度，再分别移取上述溶液1. 00、2. 00、4. 00、6. 00、8. 00 mL 置于25 mL 量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度( 换算成生药材质量浓度分别为0. 016、0. 032、0. 064、

0. 096、0. 128 g /mL ) 的溶液， 按照总还原力测定、DPPH·方法测定。

3. 4 传统醇提准确称取20 g 肉苁蓉药材，浸泡一定时间，滤过，药渣加8 倍量75% 的乙醇回流提取2 次，每次2 h，合并药液，浓缩至浸膏，加少量的热水混悬，依次用石油醚脱脂、水饱和的正丁醇萃取至无色，正丁醇部分挥

去溶剂得浸膏，转移至50 mL 量瓶中，加95% 乙醇至刻度，再分别移取上述溶液1. 00、2. 00、4. 00、6. 00、8. 00mL 置于25 mL 量瓶中，用无水乙醇定容，配成不同质量浓度( 换算成生药材浓度分别为0. 016、0. 032、0. 064、0. 096、0. 128 g /mL ) 的溶液， 按照总还原力测定、DPPH·方法测定。

4 结果与分析

4. 1 正交试验结果结果见表2，方差分析见表3、表4。

从表2 直观分析可知，各因素对肉苁蓉提取松果菊苷得率和毛蕊花糖苷的影响程度为B ＞ C ＞ A，初步认为工艺条件最佳组合为A3B2C3。方差分析结果表明酶解时间( B) 具有显著意义。综合分析，确定最佳提取工艺条件是温度60 ℃，酶解时间2. 5 h，酶用量为0. 2%。

4. 2 抗氧化活性结果由图3、图4 可知，肉苁蓉传统水提、醇提物及酶解后水提、醇提物均具有一定的抗氧化活性，但在同一体积，同一批号药材，相同生药材质量浓度下，4 种不同提取方法以酶解后用75% 乙醇提取铁氰化钾

总还原力所表征的吸光度最大， ( DPPH·) 自由基清除率也最大。铁氰化钾总还原力、( DPPH·) 自由基清除率所表现出的顺序为酶解后醇提＞ 酶解后水提＞ 醇提＞ 水提。

5 讨论

中药有效成分的提取和分离直接关系到其制剂的质量和疗效，随着中药提取领域新技术的不断应用，中药提取技术有了极大飞跃，新技术具有效率高、耗能低等明显优势。作为国家二级保护植物，并收入《国际野生植物保护

名录》和濒危动植物种国际贸易公约( CITES) 附录二的肉苁蓉［9］，提高其利用率，节约其资源，成为科研工作者研究的热点。孙萍等［10］采用微波提取技术对肉苁蓉中总黄

酮和多糖进行了提取研究，结果提取周期缩短，提取效率提高。欧阳杰等［11］采用超声集成技术研究了肉苁蓉中有效成分苯乙醇糖苷类化合物、甜菜碱和肉苁蓉多糖的提取方法。生物酶技术自20 世纪90 年代用于中药提取中以来，产生了显著性效益，已在中药生物碱［12］、黄酮［13］、香豆素［14］、多糖［15］、皂苷［15］提取等方面均有报道。但有关肉苁蓉酶解技术的报道甚少，课题组以肉苁蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷作为评价指标，研究了纤维素酶和果胶酶按一定比例混合提取肉苁蓉的最佳条件，并对酶解后醇提、酶解后水提、醇提、水提抗氧化活性作了对比分析，结果表明，肉苁蓉经复合酶辅助单元提取后，可使其中松果菊苷和毛蕊花糖苷提取率明显提高; 抗氧化方面表现出的是，酶解后肉苁蓉采用醇提较传统醇提抗氧化能力显著提高，且由曲线中点的变化来看，肉苁蓉提取物的添加量在一定实验范围内与其抗氧化性呈正相关。

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