［摘要］ 目的: 通过HPLC-MS 对新疆塔中荒漠栽培肉苁蓉Cistanche deserticola 药材60%甲醇提取物的色谱图进行鉴定。方法: 采用Agilent ZOＲBAX Eclipse Plus C18色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，以乙腈-水( 含0. 1%的甲酸) 为流动相进行梯度洗脱，流速1 mL·min － 1 ，检测波长254 nm，柱温25 ℃，进样量10 μL。结果: 在相同色谱条件下，通过与已分离得到的对照品的保留时间、相对分子质量以及碎片离子进行比较，对新疆塔中荒漠栽培肉苁蓉药材的16 个色谱峰中的17 个成分进行了准确的鉴定，分别确定为松柏苷，去甲紫丁香苷，紫丁香苷，松果菊苷，肉苁蓉苷A，类叶升麻苷( 管花苷A) ，肉苁蓉苷B，异类叶升麻苷，2'-乙酰基肉苁蓉苷A，肉苁蓉苷C，异肉苁蓉苷C，2'-乙酰基类叶升麻苷，管花苷B， epimeridinoside A，肉苁蓉苷K，肉苁蓉苷J。结论: 该研究方法适用于肉苁蓉60% 甲醇提取物色谱峰的鉴定，为全面分析该药材的化学成分提供了一定的科学数据。

［关键词］ 荒漠肉苁蓉; 肉苁蓉属; 液质联用; 甲醇提取物

肉苁蓉又名“大芸”，为著名的补益中药，在我国内蒙古、宁夏、甘肃及新疆都有分布［1］。具有补肾阳、益精血、润肠通便的功效，临床常用于治疗男子阳痿、女子不孕、腰膝冷痛、血枯便秘等［2-3］。2015年版《中国药典》一部收载的肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉和德赢vwin登录 的干燥肉质茎［4］。本课题组多年来对肉苁蓉属植物进行了系统深入的研究，该属植物化学成分主要为苯乙醇苷类，除此还有环烯醚萜及其苷类、木脂素及其苷类、苯甲醇苷类等［5］。现代药理学研究表明该属植物主要成分苯乙醇苷类化合物，具有神经保护、抗氧化、保肝、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎等作用［6-11］。在我国，肉苁蓉分布于内蒙古西部、新疆北疆及青海的柴达木盆地，在新疆南疆的塔里木盆地无自然分布。20 世纪90 年代末，为了保护塔中油田，治理沙漠，油田指挥部在塔中油田周围及沙漠公路两侧引种了大量的梭梭Haloxylon ammodendron，同时在梭梭上接种了肉苁蓉，至今已有10 多年的时间。由于南疆地区温暖的气候，加上石油基地良好的滴灌条件，其肉苁蓉产量很高，亩产鲜肉苁蓉达到500 kg以上［8］。肉苁蓉药材中很多化学成分由于取代基连接位置不同而产生了大量的同分异构体，这就给对该药材色谱峰的鉴定工作带来很大的困难，如果单纯依靠LC-MS 而没有单体化合物作为对照很难准确鉴定色谱峰的成分，因此，前期很少有文献报道这方面的工作。作者前期从塔中荒漠栽培肉苁蓉中分离得到很多单体化合物［9-11］，通过前期得到的这些单体化合物，对肉苁蓉60% 甲醇提取物的HPLC 部分色谱峰进行准确的鉴定。这样不仅可以避免后面研究肉苁蓉化学成分中对于一些已知化合物的重复鉴定工作，也为进一步对于该药材质量控制等方面的研究有一定的借鉴作用。本文主要报道通过HPLC-MS 鉴定了荒漠肉苁蓉60% 甲醇提取物的17 个成分。

1 材料

Inova-500 型核磁共振仪( 美国Varian 公司) ;6320 Ion Trap 型LC-MS 质谱仪，Eclipse XDB-C18色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ( 美国Agilent 公司) ; QUINTIX313-1CN 型1 /1 万电子天平( 赛多利斯公司) ; KQ-500DV 型超声波清洗器( 江苏昆山市超声仪器有限公司) ; KMUP-Ⅰ痕量分析型超纯水发生系统( 成都浩纯仪器设备有限责任公司) 。本实验所用的39 个对照品均是笔者前期从塔中荒漠栽培肉苁蓉中分离得到，并且通过NMＲ 等波谱技术确定其结构。39 个对照品结构分别鉴定为肉苁蓉苷J，肉苁蓉苷K，肉苁蓉苷L，肉苁蓉苷M，肉苁蓉苷N，epimeridinoside A，异肉苁蓉苷C，管花苷B，异类叶升麻苷，异角胡麻苷，肉苁蓉苷D，肉苁蓉苷C，类叶升麻苷，2'-乙酰基肉苁蓉苷A，2'-乙酰基类叶升麻苷，肉苁蓉甘B，肉苁蓉甘A，松果菊苷，管花苷A，肉苁蓉苷E，红景天苷，6'-乙酰基红景天苷， salsaside B，紫丁香苷，去甲基紫丁香苷，松柏苷，( 2E，6E) -3，7-dimethyl-8-hydroxyoctadien-1-O-β-D-glucoside，( + ) -丁香脂素，( + ) -丁香脂素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，( + ) -isoeucommin A，eucomminA，( + ) -松脂素单甲基醚-β-D-葡萄糖苷，落叶松脂醇-4'-O-β-D-葡萄糖苷，落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷，conicaoside，dehydrodiconiferyl alcohol 4-O-β-Dglucopyranoside，橙皮素A，阿拉善苷A，6-去氧梓醇。以上所有对照品纯度均＞ 98. 0%。乙腈为色谱纯( 美国DikmaPure) ，水为超纯水，其他试验过程中用到的试剂均为分析纯试剂，由北京化工厂生产。本实验所用药材肉苁蓉于2010 年11 月采自新疆塔中荒漠地区，经北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticola 的干燥肉质茎，标本存放于北京大学中医药现代研究中心( 标本编号CD201011) 。

2 方法与结果

2. 1 对照品溶液制备取前期从肉苁蓉中得到的39 个对照品各约1 mg，精密称定，分别置5 mL 量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得各单一对照品溶液。

2. 2 供试品溶液的制备参考2015 年版《中国药典》，取本品粉末( 过四号筛) 约1 g，精密称定，置100 mL 棕色瓶中，精密加入60%甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定质量，浸泡30 min，超声处理40 min，放冷，再称定质量，加50% 甲醇补足减少的质量，摇匀，静置，取上清液，用0. 45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2. 3 色谱条件采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，检测波长254 nm，柱温25 ℃; 以乙腈( A) -0. 1% 甲酸水溶液( B) 为流动相，梯度洗脱( 0 ～ 20 min，5% ～ 15%A; 20 ～ 50 min，

15% ～ 30% A; 50 ～ 60 min，30% ～ 50% A; 60 ～70 min，50% ～ 95%A) ; 流速1. 0 mL·min － 1，进样量10 μL。

2. 4 质谱条件毛细管温度350 ℃; 毛细管电压3 500 V; 夹套气( 氮气) 流速12. 0 L·min － 1 ; 辅助气( 氮气) 压力206. 8 kPa; 质谱全扫描范围为m/z50 ～ 1 000; 碰撞气体氦气，试验过程中碰撞能量自动选择; 正负离子模式各采集1 针。

2. 5 对照品测试分别将2. 1 项下制备的39 个对照品溶液在2. 3 项色谱条件以及2. 4 项质谱条件下进行测试，并记录其保留时间和相对分子质量( 表1) 。

2. 6 供试品溶液测定取采自新疆塔中荒漠地区的肉苁蓉药材，按2. 2 项下方法制备供试品溶液，再按2. 3 项下的色谱条件以及2. 4 项下的质谱条件进行测定，测定其HPLC 色谱图以及正负离子模式下的质谱图( 图1 ～ 3) 。

2. 7 药材HPLC 色谱图鉴定在同一条件下( 2. 3项色谱条件以及2. 4 项质谱条件) ，通过比较供试品和对照品的保留时间以及相对分子质量进行成分鉴定，供试品色谱峰( 图1) 具体鉴定过程如下。

2. 7. 1 色谱峰1 的鉴定色谱峰1 的保留时间为16. 67 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z

365 为［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 387 ［M + COOH］－ ，确定峰1 的相对分子质量为342。同时给出碎片离子m/z 179，来源于苷键断裂失去1 分子葡萄糖163 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰1 鉴定为松柏苷。

2. 7. 2 色谱峰2 的鉴定色谱峰2 的保留时间为17. 36 min，负离子模式下给出准分子离子峰m/z357［M – H］－ ，393［M + Cl］－ ，确定峰2 的相对分子质量是358。同时给出碎片离子m/z 195，来源于苷键断裂失去1 分子葡萄糖163 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰2 鉴定为去甲紫丁香苷。

2. 7. 3 色谱峰3 的鉴定色谱峰3 的保留时间为19. 04 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z395［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 417［M + HCOO］－ ，确定峰3 的相对分子质量是372。同时给出碎片离子m/z 209，来源于苷键断裂失去1 分子葡萄糖163 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰3 鉴定为紫丁香苷。2. 7. 4 色谱峰4 的鉴定色谱峰4 的保留时间为27. 66 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z

804［M + NH4］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 785［M – H］－ ，确定峰4 的相对分子质量是786。同时给出碎片离子m/z 623，来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量鉴定色谱峰4 为松果菊苷。

2. 7. 5 色谱峰5 的鉴定色谱峰5 的保留时间为31. 48 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z818［M + NH4］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 799［M – H］－ ，确定峰5 的相对分子质量是800。同时给出碎片离子m/z 637，来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量确认色谱峰5 为肉苁蓉苷A。

2. 7. 6 色谱峰6 的鉴定色谱峰6 的保留时间为

34. 17 min，正离子模式下给出2 个准分子离子峰m/z 846，642 ［M + NH4］+ ，负离子模式下也给出2个准分子离子峰m/z 827，623 ［M – H］－ ，推测峰6可能含有2 个化合物，相对分子质量分别为828，624。同时分别给出碎片离子m/z 665，461，来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da，碎片离子m/z 622 来源于乙酰基酯键断裂。这2 个化合物都分离得到，结合对照品的保留时间和相对分子质量鉴定色谱峰6 为类叶升麻苷和管花苷A 的混合物。

2. 7. 7 色谱峰7 的鉴定色谱峰7 的保留时间为35. 34 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z832［M + NH4］+ ，837［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 813［M – H］－ ，得出峰7 的相对分子质量是814。同时给出碎片离子m/z 637，来源于酯键断裂失去1 分子阿魏酰基177 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量鉴定色谱峰7 为肉苁蓉苷B。

2. 7. 8 色谱峰8 的鉴定色谱峰8 的保留时间为36. 17 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z647［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 623［M – H］－ ，确定峰8 的相对分子质量是624。同时给出碎片离子m/z 461，来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da。结合对照品的保留时间和相对相对分子质量鉴定色谱峰8 为异类叶升麻苷。

2. 7. 9 色谱峰9 的鉴定色谱峰9 的保留时间为38. 20 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z860［M + NH4］+ ，865［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 841［M – H］－ ，877［M +Cl］－ ，确定峰9 的相对分子质量是842。同时给出碎片离子m/z 679，636 来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da 以及1 分子乙酰基43 Da。与对照品的保留时间和相对分子质量一致，鉴定色谱峰9为2'-乙酰基肉苁蓉苷A。

2. 7. 10 色谱峰10 的鉴定色谱峰10 的保留时间为39. 04 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z656［M + NH4］+ ，661［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 637［M – H］－ ，673［M +Cl］－ ，确定峰10 的相对分子质量是638。同时给出碎片离子m/z 475，来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da。与对照品的保留时间和相对分子质量一致，鉴定色谱峰10 为肉苁蓉苷C。

2. 7. 11 色谱峰11 的鉴定色谱峰11 的保留时间为40. 82 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z661［M + Na］+ ，677［M + K］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 637［M – H］－ ，673［M + Cl］－ ，可以确定峰11 的相对分子质量是638。同时给出碎片离子m/z 475，来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰11 鉴定为异肉苁蓉苷C 。

2. 7. 12 色谱峰12 的鉴定色谱峰12 的保留时间为41. 48 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z684 ［M + NH4］+ ，689 ［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 665 ［M – H］－ ，可以确定峰12 的相对分子质量是666。同时给出碎片离子m/z503，460 来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da以及1 分子乙酰基43 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰12 鉴定为2'-乙酰基类叶升麻苷。

2. 7. 13 色谱峰13 的鉴定色谱峰13 的保留时间为44. 29 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z689［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 665［M – H］－ ，得出峰13 的相对分子质量是666。同时给出碎片离子m/z 503，460 来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da 以及1 分子乙酰基43 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰13 鉴定为管花苷B。

2. 7. 14 色谱峰14 的鉴定色谱峰14 的保留时间为46. 67 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z675［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 651［M – H］－ ，得出峰14 的相对分子质量是652。同时给出碎片离子m/z 475，来源于酯键断裂失去1 分子阿魏酰基177 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰14 鉴定为epimeridinoside A。

2. 7. 15 色谱峰15 的鉴定色谱峰15 的保留时间为49. 90 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z698［M + NH4］+ ，703［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 679［M – H］－ ，715 ［M +Cl］－ ，得出峰15 的相对分子质量是680。同时给出碎片离子m/z 517，474 来源于酯键断裂失去1 分子咖啡酰基163 Da 以及1 分子乙酰基43 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰15 鉴定为肉苁蓉苷K。

2. 7. 16 色谱峰16 的鉴定色谱峰16 的保留时间为55. 36 min，正离子模式下给出准分子离子峰m/z717［M + Na］+ ，负离子模式下给出准分子离子峰m/z 693 ［M – H］－ ，729 ［M + Cl］－ ，得出峰16 的相对分子质量是694。同时给出碎片离子m/z 517，474 来源于酯键断裂失去1 分子阿魏酰基177 Da 以及1 分子乙酰基43 Da。结合对照品的保留时间和相对分子质量将色谱峰16 鉴定为肉苁蓉苷J。以上采用HPLC-MS 技术并结合已分离得到的对照品的相对分子质量、保留时间以及碎片离子对肉苁蓉60%甲醇提取物色谱峰进行鉴定，结果对16 个色谱峰中的17 个成分进行了准确的鉴定( 表2) 。

3 讨论

3. 1 供试品制备方法的选择本研究主要目的是鉴定肉苁蓉的HPLC 色谱峰，因此，选择提取溶剂和提取方法都是基于能得到更多的HPLC 色谱峰而进行的。课题组长期开展肉苁蓉药材的相关研究，在质量分析方面做了很多工作。本文选择肉苁蓉药材的提取溶剂和提取方法也是在参考课题组前期的一些分析工作以及2015 年版《中国药典》基础上，最终选择采用60%甲醇溶剂超声提取40 min 作为提取方法。

3. 2 HPLC-MS 条件选择本文对色谱柱的选择是在参考课题组前期对肉苁蓉药材质量分析的基础上，考察了Agilent ZOＲBAX Eclipse Plus C18( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) ，Dionex C18( 4. 6 mm ×250 mm，5 μm) ，Thermo C18( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) 色谱柱，最终选择Agilent ZOＲBAX EclipsePlus C18色谱柱( 4. 6 mm × 250 mm，5 μm) 对肉苁蓉药材有较好的分离效果; 39 个对照品包括苯乙醇苷、木脂素和苯丙素类型，因此，检测波长选择了254 nm;同时考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0. 1% 磷酸水、乙腈-0. 1% 甲酸水等流动相对色谱分离和质谱检测的影响，最终选择乙腈-0. 1%甲酸水作为流动相。

3. 3 小结本研究建立的方法对荒漠肉苁蓉60%甲醇提取物16 个色谱峰中的17 个成分进行了准确的鉴定。研究结果不仅对该药材进一步的质量分析有一定的借鉴作用，同时也可以避免对该药材已知化合物结构鉴定的一些重复工作。但是，总体上鉴定的色谱峰比较少，还有很多色谱峰由于未分到对照品而没有得到鉴定，大部分鉴定的成分是苯乙醇苷类化合物，木脂素类化合物很少。这可能是由于参考2015年版《中国药典》的提取方法主要针对苯乙醇苷类化合物，也可能因为该药材提取物中松果菊苷和类叶升麻苷化合物含量太大，导致其他含量小的化合物难以检测到，具体原因有待于进一步阐明。

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