［摘要］ 目的: 探讨肉苁蓉多糖( CDPS) 对Aβ25 － 35诱导的大鼠肾上腺嗜络瘤细胞( PC12) 损伤BDNF 基因表观遗传的调控作用，分析组蛋白乙酰化对BDNF 基因转录的影响。方法: 采用Aβ25 － 35诱导PC12 细胞损伤建立阿尔茨海默病( AD) 体外模型，在给予阳性药人参皂苷Ｒd( GSrd) 、CDPS 高、低浓度后，流式细胞术检测细胞凋亡情况; Hoechst33258 染色观察细胞形态的变化。ELISA 法检测组蛋白乙酰化酶( HATs) 、组蛋白去乙酰化酶2( HDAC2) 和BDNF 的含量变化。Western Blotting 检测P300 和HDAC2 的表达水平变化。染色质免疫共沉淀( CHIP) 检测BDNF exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平的变化和HDAC2 含量变化。结果: 20 μmol·L － 1 Aβ25 － 35

暴露PC12 细胞48 h 后成功建立AD 细胞凋亡模型。GSrd 组、CDPS 高、低浓度作用48 h 后，HATs表达增加( P ＜ 0． 05) ，HDAC2 表达下降( P ＜ 0． 05) ，BDNF 水平提高( P ＜ 0． 05) ，并且有剂量依赖性。ChIP

分析证实Aβ25 － 35诱导PC12 细胞后BDNF 基因exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平明显下降，且降低呈HDAC2 依赖性; 给药48 h 后，BDNF 基因exon Ⅳ组蛋白H3 乙酰化水平显著升高，HDAC2 水平显著降低。结论: CDPS

可能通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，抑制HDAC2 的表达来活化BDNF 基因转录从而起到保护PC12 细胞、刺激PC12 细胞再生的作用。

［关键词］ 肉苁蓉多糖; PC12 细胞; 组蛋白乙酰化酶2; 组蛋白H3

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉( Cistanche deserticolaY． C． Ma) 或德赢vwin登录 ［Cistanche Tubulosa( schrenk) Ｒ． Wight］的干燥带鳞叶的肉质茎。入肾经，能补肾阳、益精血; 入大肠经，能润肠燥、缓通便［1］。研究表明［2］，多数药用植物的多糖都具有显著的生物活性，如免疫调节、抗衰老、抗炎保肝、抗肿瘤等。

阿 尔茨海默病( Alzheimer's disease，AD) 是一种进行性的神经退行性疾病［3］。认知功能下降是该病的主要病理特征，但目前对于认知功能下降的原因尚不明确，同时也缺乏有效的治疗方法。大量研究［4］发现，组蛋白乙酰化异常是AD 发病过程中常见的表观遗传异常。在如认知功能障碍的AD 特征性症状病理机制研究中发现，组蛋白乙酰化修饰调节了记忆相关基因的表达情况［5 － 7］。组蛋白乙酰化动态平衡由组蛋白乙酰化酶( HATs) 和组蛋白去乙酰化酶( HDACs) 2 种活性酶共同调节。HATs 主要对染色质核小体的核心组蛋白N 端尾部赖氨酸残基进行可逆性乙酰化修饰，中和DNA 和相邻组蛋白之间的正电荷，促进DNA 解螺旋，松弛染色质结构，有利于转录因子与DNA 功能区结合，最终激活转录。目前发现的参与学习记忆的组蛋白乙酰化酶是P300 /CBP［8］。另外，有研究表明［9］HATs 活性降低参与到神经退行性疾病中。

脑源性神经营养因子( brain derived neurotrophicfactor，BDNF) ，是神经元和神经胶质重要的神经营养因子，被认为是记忆形成过程中的关键蛋白之一，是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需的物质［10 － 11］。一些研究表明BDNF 在齿状回的颗粒细胞层( GCL) 中高度表达，表明其通过TrkB 受体参与突触可塑性和神经元发育。此外，BDNF 表达和释放也可以通过遗传和表观遗传变异，如组蛋白修饰［12 － 13］。P300 /CBP是具有HAT 活性的转录共激活剂，对长期记忆过程有重要影响，取决于从头基因表达［14］，并且BDNF的表达受P300 /CBP 的活性调节［15］。研究证实［16］，不仅环境因素可以造成BDNF 启动子区的长期表观遗传改变，药物刺激也会如此，如丙咪嗪通过HDAC5 的下调增强bdnf P4 和P6 的H3 乙酰化。但是，我们仍不清楚这些快速的表观遗传变化是否参与在给与肉苁蓉多糖( CDPS) 后Aβ25 － 35诱导的PC12 细胞中调节BDNF 转录表达。本研究以GＲsd 为阳性药［17］，结果证实在Aβ25 － 35诱导的AD 细胞模型给与肉苁蓉3 种有效成分后，通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，增加BDNF 表达，从而改善、促进神经元存活。本研究表

明BDNF 表达和释放与表观遗传修饰，特别是和由HDAC 和HAT 调节的组蛋白乙酰化改变密切相关。

材料与方法

1 药品与试剂

DMEM 培养基( 美国Gibco 公司，批号: 12491-015) ; FBS( 美国Gibco 公司，批号: 10099141) ; MTT( 美国Sigma 公司，批号: M5655) ; BDNF 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号:3374518) ; HATs 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号: 6907299) ; HDAC2 酶联免疫试剂盒( 武汉新启迪生物科技有限公司，批号:6907236) ; 人参皂苷( 成都曼斯特生物科技有限公司，批号: A0245) ; Aβ25 － 35( 上海吉尔生化有限公司，批号: 10-375) ; HDAC2 多克隆抗体( 英国Abcam 公司，批号: ab32117) ; P300 多克隆抗体( 英国Abcam公司，批号: ab142163) ; β-actin 多克隆抗体( 北京中杉金桥生物技术有限公司，批号: ZM-0001) ; HＲP-羊抗兔二抗( 英国Abcam 公司，批号: ab205718) ; 彩色预染蛋白分子量标准( 美国Sigma 公司) ; ECL 显色液( Theromo Fisher Scientific，批号: 10318H08) ; 核蛋白提取试剂盒( 康为世纪生物科技有限公司，批号:

CW0199S) ; 蛋白磷酸酶抑制剂混合物( 康为世纪生物科技有限公司，批号: CW2383S) ; 染色质免疫沉淀试剂盒( 德国Merck Millipore 公司，批号: 17-371) 。

2 主要仪器

PL 203 电子天平( 梅特勒-托利多仪器上海有限公司) ; TGL 16 超低温离心机( 长沙平凡仪器仪表有限公司) ; TU 1901 紫外分光光度计( 上海精密仪器仪表有限公司) ; DYY 6C 电泳仪电源( 北京市六一仪器厂) ; 聚丙烯酰胺凝胶电泳( WesternBlotting 电泳，北京市六一仪器厂) ; 转膜装置( 美国Bio-ＲAD 公司) ; wH 1 微型旋涡混合器( 上海沪西分析仪器厂) ; 十万分之一电子天平( 美国MettlerToledo 公司) ; 10 μL，100 μL，200 μL 和1 000 μL 移液枪( 美国Ｒainin Instrument 公司) ; MDF U3386S低温冰箱( 日本三洋公司) ; SB2200 T 超声波清洗器( 上海必能信超声有限公司) ; Model680 酶标仪( 日本Bio-ＲAD 公司) ; C6 流式细胞仪( 美国BD Accuri公司) ; Odyssey 双色红外荧光成像系统( 美国LI-COＲ 公司) ; UH 100A 超声波细胞粉碎仪( 天津奥特赛恩斯有限公司) 。

3 CDPS 的制备及鉴定

肉苁蓉生药材，经热乙醇浸泡3 h 后，用纱布过滤，弃滤液。药渣加水煎煮3 次，每次1 ～ 2 h，过滤，合并滤液( 呈棕红色) 。蒸发浓缩后5 000 r·min － 1离心10 min 去沉淀，上清液加2 ～ 3 倍体积的95%乙醇沉淀，4 ℃ 静置24 h，次日，于6 000 r·min － 1( 4 ℃) 离心20 min，收集沉淀。沉淀经水复溶、脱蛋白、透析、冷冻干燥后获CDPS。通过紫外分光光度法测定多糖含量＞ 90%，其余为极少量的几种单糖和低聚糖。

4 细胞

PC12 细胞株( 北京协和细胞资源中心) 。

5 细胞模型建立取对数生长期的PC12 细胞，按照每毫升3 ×104 个的密度接种到96 孔培养板中，每孔0． 1 mL，培养48 h 后，用Aβ25 － 35和CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 共

同作用48 h，收集细胞进行实验。

6 流式细胞术检测凋亡情况用去离子水将10 × Binding Buffer 稀释成1 ×Binding Buffer; 2 000 r·min － 1 ( 室温) 离心5 ～ 10 min，收集细胞; 细胞洗涤: 用4 ℃预冷的1 × PBS 重悬细胞，2

000 r·min － 1 离心5 ～ 10 min，洗涤细胞; 加入300 μL 的1 × Binding Buffer 悬浮细胞; Annexin VFITC标记: 加入5 μL 的Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育15 min; 上机前5 min 再加入5 μL的PI 染色。在1 h 内，进行流式细胞仪的检测和观察。

7 酶联免疫法测定HATs，HDAC2 和BDNF药物处理后，收集PC12 细胞培养液，2 500r·min － 1离心10 min，取上清测试。制作标准曲线，按照试剂盒操作步骤，加入规定体积的检测试剂，避光孵育30 min 后，在酶标仪上测定450 nm 处的吸光度( A) 值并计算HATs，HDAC2 和BDNF 的含量。各实验组设置3 个复孔，实验重复3 次。

8 Western Blotting 电泳ＲIAP 缓冲液裂解PC12 细胞，提取核蛋白，BCA法进行蛋白质含量定量。加ＲIAP 缓冲液，将各组蛋白量调整一致。SDS-PAGE 电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部，转移至NC 膜( 100 V，2 h) ，预染蛋白marker 确定蛋白分子量标准位置。用50 g·L － 1 脱脂奶粉封闭1 h。一抗P300 /CBP( 1 ∶ 5 000) ，HADC2( 1∶ 5 000) 和β-actin( 1 ∶ 200) 多克隆抗体分别用封闭液按比例稀释后，4℃孵育过夜，再用TBS 脱色3次，每次10 min。辣根过氧化物标记的山羊抗兔多克隆抗体( 1∶ 5 000) 室温孵育1 h，加入DAB 显色后用Bandscan 分析软件分析条带灰度，进行半定量比较分析，均采用自身灰度值校正，以目的基因的条带灰度与管家基因β-actin 的灰度比值表示蛋白的表达水平。

9 染色质免疫共沉淀( ChIP)在装有20 mL 生长培养基的150 mm 培养皿中培养PC12 细胞，长到80% ～90%的密度，用1%甲醛在室温下搅拌15 min。加入甘氨酸( 125 mmol·L － 1 终浓度) 终止固定。在PBS 中洗涤组织并将沉淀悬浮在十二烷基硫酸中( SDS) 裂解缓冲液( 50 mmol·L － 1Tris，10 mmol·L － 1 EDTA，1 % SDS) 。以6 × 10 s 条件将染色质在冰上超声处理，获得约200 ～ 400 bp 的碎片。将1 /10 的裂解物保存为input 用于ChIP 标准化。每组加入针对乙酰化组蛋白H3 或HDAC2抗体的多克隆抗体样品并在4 ℃下温和混合温育过夜，并使用兔或小鼠IgG 作为阴性对照。将免疫复合物与磁珠( life technologies) 一起孵育4 ～ 6 h，然后依次用150 mmol·L － 1 NaCl 低盐缓冲液和500 mmol·L － 1 NaCl 高盐缓冲液洗涤，重悬浮于含0． 1 mol·L － 1NaHCO3的120 mL 1%SDS 中，在65 ℃温育过夜。解交联样品用ＲNase 和蛋白酶K( 美国Sigma-Aldrich

公司) 处理，并通过QIAquick PCＲ 纯化试剂盒纯化DNA( Qiagen) 。对免疫沉淀的DNA 样品进行定量实时PCＲ。PCＲ 进行靶基因的转录控制区的片段扩增( 约200 bp) 。引物设计如下: bdnf 外显子IV

( 5'-TCAGGAGTACATATCGGCCACCA-3'，5'-GTAGGCCAAGTTGCCTTGTCCGT-3') GAPDH ( 5'-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3'， 5'-CTGCGGGAGAAGAAAGTCAG-3') 。

10 统计学处理

所有数据均以珋x ± s 表示。采用SPSS 软件进行统计分析，多个实验组比较采用单因素方差分析。P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。