结果

1 CDPS 对Aβ25 － 35诱导损伤的保护作用结果显示，Aβ25 － 35作用细胞48 h 后，细胞存活率已降低为( 42． 91 ± 4． 59) %，与对照组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05 ) 。阳性药人参皂苷( GSrd) 对细胞有保护作用，与模型组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) ; CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 )对于AD 模型细胞均有保护作用，并且有剂量依赖性，与模型组比较差异具有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。MTT 法结果见表1。

2 CDPS 对于损伤细胞凋亡情况的影响

2． 1 流式细胞术检测细胞凋亡率由图1 可知，正常组的细胞凋亡率为0． 0%，均为活细胞; 与正常组相比，模型组的细胞凋亡率明显上升( 33. 7%) ，差异有统计学意义( P ＜ 0. 05 ) ，说明Aβ25 － 35引起PC12 细胞的凋亡; 与模型组比较，给与GSrd 后，细胞凋亡率明显降低到( 0． 8% ) 。给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 组干预后，明显降低了细胞的凋亡率，且有剂量依赖性，分别为18． 1% 和12． 1% ，表明CDPS 能抑制Aβ25 － 35

诱导PC12 细胞的凋亡，结果见表2。

2． 2 CDPS 对于PC12 细胞中HATs 和HDAC2 含量的影响结果显示，与HATs 活性模型组相比，空白对照组显著降低; HDAC2 活性模型组相比空白对照组显著升高; 给与GSrd 后HATs 活性显著升高，HDAC2 活性显著降低。给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，与模型组相比HATs 活性显著升高，HDAC2 活性显著降低，且有剂量依赖性。说明Aβ25 － 35诱导PC12 细胞的凋亡过程中组蛋白乙酰化修饰参与其中，HATs 和HDAC2 的酶活性变化对PC12 细胞存活产生了影响，结果见图2。

3 CDPS 组PC12 细胞中P300 /CBP 和HDAC2 蛋白表达的影响

P300 /CBP 是目前发现的与学习记忆相关的HAT，HDAC2 是公认的与学习和记忆相关的HDAC。本研究中采用Western Blot 分析各组细胞中P300 /CBP 和HDAC2 的表达情况。结果显示，与空白对照组相比模型组P300 /CBP 表达量降低( P ＜ 0. 05) ; 给与GSrd 后P300 /CBP 表达增加( P ＜ 0. 05) ; 给与CDPS( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，P300 /CBP 表达增加( P ＜ 0. 05) ，且有剂量依赖性。结果与酶活性检测结果一致( 见图3) 。

4 CDPS 组PC12 细胞中BDNF 分泌的影响BDNF 对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应。为了探究CDPS 对Aβ25 － 35诱导PC12 细胞凋亡的保护机制。我们用ELISA 法检测各组细胞培养基中BDNF蛋白分泌量。结果显示，与空白对照组相比模型组BDNF 分泌减少( P ＜ 0． 05) ; 给与GSrd 后BDNF分泌增加( P ＜ 0． 05) ; 给与CDPS ( 50 和150 μg·mL － 1 ) 干预后，BDNF 分泌增加( P ＜ 0． 05) ，且有剂量依赖性。说明CDPS 介导的神经保护作用随着BDNF 分泌增加而增强，结果见表3。

5 CDPS 对于PC12 细胞H3 乙酰化水平的影响有研究表明BDNF 的分泌受到组蛋白乙酰化修饰影响。为了确定本研究PC12 细胞中BDNF 的组蛋白乙酰化修饰是否受到Aβ25 － 35的影响，我们采用染色质免疫共沉淀法来分析各组细胞中AC-H3 和HDAC2 水平。ChIP 分析显示在Aβ25 － 35诱导后，BDNF 的外显子IV 的HDAC2 水平( 图4A) 和H3乙酰化水平( 图4B) 显著降低，这与BDNF 表达的下调一致( 见表3) 。给与CDPS 后BDNF 外显子IV

区H3 乙酰化水平增加( 图4B) ，与模型组相比有显著性差异。GSrd 组BDNF 外显子IV 区H3 乙酰化水平增加与文献［17］报道一致。通过以上结果可知CDPS 介导的神经保护作用过程伴随着BDNF 分泌的显著增加，而BDNF 分泌受到Ac-H3 和HDAC2调控，见表4。

讨论

Aβ 异常产生与沉积是AD 的早期事件和核心病理改变。介导细胞凋亡［18］、炎症级联反应［19］、氧化应激、线粒体功能障碍等毒性效应，加剧AD 的发展。体内、体外研究均显示，Aβ25 － 35具有与Aβ1 － 42类似的凝聚性质及毒性作用，能够引起神经元损伤、学习记忆能力受损，且因其具有易于溶解等优势，被广泛用于Aβ 损伤及毒性作用的研究［20］。MTT 结果表明，Aβ25 － 35浓度20 μmol·L － 1，作用时间48 h 条件下培养的PC12 细胞会出现明显的凋亡特征，可作为较理想的AD 细胞模型。V-FITC 及PI 双染流式细胞技术检测不同实验组PC12 细胞的凋亡情况。Aβ25 － 35处理后的细胞凋亡率明显增高，给予CDPS 后，PC12 细胞的凋亡率明显下降，且有剂量依赖性。表明CDPS 具有抑制细胞凋亡的作用，因此本研究细胞模型可以作为评价CDPS 对Aβ25 － 35诱导PC12 细胞损伤保护作用的理想细胞模型。

GSrd 是从天然植物中分离出的单体成分，具有活跃的生物活性。研究［21］ 表明GSrd 能够降低PC12 细胞内活性氧簇水平、通过减少丙二醛含量、增强抗氧化酶的活性来抵抗过氧化氢诱导的细胞毒性损伤。体内实验发现GSrd 可通过重建Ac-H3 和HDAC2 之间的平衡，增加BDNF 表达，从而改善、促进神经元存活，改善慢性脑损伤［17］。CDPS 与GSrd类似，均从补益类天然植物中分离得到，且均有神经营养和神经保护作用。研究发现，CDPS 可通过增加Bcl-2 的表达，降低caspase-3 的表达，抑制海马神经元凋亡，改善AD 模型大鼠的学习记忆能力。本课题组前期实验结果［22 － 26］表明，CDPS 可显著提高东莨菪碱所致学习记忆障碍模型小鼠突触素生长相关蛋白43( GAP-43) 的表达，增多海马区突触数量，增强神经突触的可塑性，缓解学习障碍表现。并观察到CDPS 可增加D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织SOD 活性，减少MDA 含量，改善脑组织神经元损伤，并激活cAMP/PKA/CＲEB 信号通路，以改善学习记忆障碍。因此本研究选GSrd 作为阳性药。本研究探索了CDPS 介导的BDNF 上调机制。研究表明BDNF 在突触可树性、神经发生及细胞存活中的重要作用［27］。但是这些调控机制慢慢向表观遗传机制退让，通过表观遗传修饰影响基因的表达在多种人类疾病中发挥重要作用。组蛋白赖氨酸残基在组蛋白乙酰基转移酶HATs 的作用下发生乙酰化，从而使染色质结构松解，暴露转录因子与DNA 作用的结合位点，启动转录机制，而组蛋白去乙酰化酶HDAC 则与转录抑制相关。HDAC2 是大脑中最高度表达的Ⅰ类HDAC 之一［28］。HDAC2 的升高可伴随人类神经变性大脑的认知衰退［28 － 29］，并且HDAC2 也负面调节健康小鼠脑中的记忆和突触可塑性［30 － 31］。本研究揭示AD 细胞模型中H3 乙酰化水平显著降低、HDAC2 显著增加的机制。这一研究说明BDNF 受到表观遗传途径的调控。目前，通过使用非选择性HDAC 抑制剂在逆转认知缺陷方面的旨在增加组蛋白乙酰化的药理学治疗中已取得可喜的结果［32 － 33］。本研究显示AD 细胞模型中HDAC2 水平升高，BDNF 分泌量减少; 应用GSrd 阻断HDAC2 会增强BDNF 的表达，在给与CDPS 处理后结果相似。基于以上体外试验，本课题组将进一步对CDPS 对AD 病理状态下体内组蛋白乙酰化水平的影响进行研究，并进行后续实验。

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