艾拉旦·麦麦提艾力“，李洋，姚军“，袁洁

（1．新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2．新疆医科大学厚博学院，新疆克拉玛依 834000）

中图分类号 R284.2；R285：0629.1 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2021）12-1479-06DO1 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.12.12

摘 要 目的：分离德赢vwin登录 多糖水提物，考察分离物的体外免疫活性。方法：采用AB-8大孔吸附树脂法对德赢vwin登录 多糖进行脱色，以多糖保留率和多糖脱色率为指标进行综合评分，以吸附速率、脱色时间、上样质量浓度为因素，采用正交实验优化脱色工艺并验证。采用DEAE-650M离子交换柱层析柱对脱色后的德赢vwin登录 多糖水提物进行分离。采用CCK-8法检测不用质量浪度（6.25～100μg／mL）分离前、后各种多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖率的影响，采用Griess法和酶联免疫吸附测定法检测低、中、高质量浓度（12.5、25、50μg／mL）分离前、后各种多糖对脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞一氧化象（NO），白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）释放量的影响。结果：AB-8大孔吸附树脂的最优脱色工艺为吸附流速1.2BV／h，脱色时间9h，上样质量浓度25mg／mL；3次验证实验的综合评分分别为63.43％，63.29％、63.34％，平均值为63.35％（RSD＝0.11％，n＝3）。从德赢vwin登录 多糖水提物中分离出1种中性多糖（CTZ）和5种酸性多糖（CT1、CT2．CT3、CT4．CT5），含量分别为299.2,168.0,123.2、121.6,54.4.11.2mg／g。与对照组比较，6.25～100μg／mL的CTZ（6.25pg／mL除外）、CT2、CT4、CT5和6.25μg／mL的CTC（即分离前的多糖）均可显著增加RAW264.7细胞的增殖率（P＜0.05），6.25～100μg／mL的CT1，CT3和50μg／mL的CTC均可显著降低RAW264.7细胞的增殖率（P＜0.05）。与LPS组比较，低、中、高质量浓度CTC、CT2、CT3、CT5组和低质量浓度CIZ组细胞的NO释放量均显著降低（P＜0.05），高质量浓度CT1，CT4组细胞的NO释放量均显著升高（P＜0.05）；低、中、高质量浓度各组细胞的IL-6（高质量浓度CT1组和低质量浓度CT5组除外），TNF-a释放量（中质量浓度CT1组除外）均显著降低（P＜0.05）。结论：本研究所优化的大孔吸附树脂脱色工艺稳定、可行；德赢vwin登录 多糖水提物中可分离出1种中性多糖，5种酸性多糖，其中酸性多糖CT2

关键词 德赢vwin登录 多糖；脱色；分离；免疫活性

德赢vwin登录 为列当科德赢vwin登录 Cistanche tubulo-sa（Schenk）Wight的干燥带鳞叶的肉质茎。现代研究表明，德赢vwin登录 含有苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、木脂素类、多糖类、生物碱类等多种生物活性物质，具有壮阳、通便、保肝、抗衰老、抗疲劳、增强免疫力及益智等功效“-”，可用于临床治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等症。

德赢vwin登录 多糖水提物呈棕黄色，本课题组前期实验发现，该水提物中除含德赢vwin登录 多糖外，还包含水溶性色素、蛋白质等非目标成分，这给多糖的分离纯化、生物活性研究等造成了很大的困难。传统的有机溶剂脱色处理会破坏粗提物中目标成分的化学结构，降低后者的药理活性，并引入对人体有害的成分＂。大孔吸附树脂是中药提取物中多糖脱色的常用材料，是一种性价比较高的高分子吸附材料，其物理、化学性质稳定，利用其对色素成分的选择吸附和筛分性能，可针对性地去除中药提取物中的色素，加之其可通过酸洗碱洗的方式进行再生，因而得以广泛应用＂。本研究拟利用大孔吸附树脂对德赢vwin登录 多糖水提物进行脱色处理，并采用正交实验对脱色条件进行优化；提取物经脱色处理后，依据多糖所携带基团性质的不同，拟用离子交换柱层析的方法，进一步分离德赢vwin登录 多糖中的中性、酸性多糖组分。

已有研究表明，植物多糖具有免疫调节作用，是天然的免疫调节剂，可以激活补体系统和T／B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞等免疫细胞，同时亦可促进多种细胞因子的释放，并促进抗体的生成等-。脂多糖（LPS）可激活巨噬细胞的炎症信号通路，诱导一氧化氮（NO）和诸如白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）等促炎细胞因子诱导的合成及释放，从而引发机体一系列的炎症反应。本研究拟建立LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症模型，从德赢vwin登录 多糖对巨噬细胞增殖、炎症因子分泌和NO产生等方面的影响入手，初步评价其对机体免疫活性的影响，旨在为深入研究德赢vwin登录 多糖抗炎活性物质基础以及开发其多糖资源提供理论依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括UV-2550型紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）、Multiskan Go型全波长酶标仪（美国Thermo Fisher Scientifie公司）、Herocell 180型CO2培养箱（上海润度生物科技有限公司）、AB135-S型分析天平（瑞士Meuler Toledo公司）、OSB-2100EYELA型油浴锅（上海爱郎仪器有限公司）、N-1001EYELA型旋转蒸发仪（上海爱郎仪器有限公司）、THZ-100型恒温摇床（上海一恒仪器有限公司）、3-18K型离心机（德国SartoriusAG公司）IX71-12FL／PH 型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）等。

1.2 主要药品与试剂

德赢vwin登录 多糖水提物（批号20180201，每克多糖相当于17.36g德赢vwin登录 ）由新疆win德赢官方 惠赠，样品于密封、阴凉、干燥处存放；蒽酮（批号20190120）购自上海科丰实业有限责任公司；无水葡萄糖（分析纯，批号：20181115）购自天津市科密欧化学试剂有限公司；DEAE-650M离子交换填料（粒径40～90μm）购自日本Tosoh公司；AB-8大孔吸附树脂（粒径3.3～1.25mm）购自天津市光复精细化工研究所；胎牛血清（FBS，批号 1966173C）购自美国Gibco公司；DMEM高糖培养基（批号AF29562465）、链霉素＋青霉素双抗（批号AB10166019）、胰蛋白酶（批号SH30042.01）均购自美国Hyclone公司；磷酸盐缓冲液（PBS，批号2035126．pH7.4）购自以色列BI公司：NO检测试剂盒（Griess法）（批号011020200430）购自北京索莱宝科技有限公司：LPS购自美国Sigma公司：CCK-8细胞增殖毒性测定试剂盒（批号BJ05203090）购自北京博奥森生物技术有限公司：IL-6（批号202012）、TNF-a（批号201922）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

13 细胞株

小鼠巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 方法与结果

2.1 相关指标的检测

2.1.1 色素波长的选择及多糖脱色率的计算 德赢vwin登录 多糖水提物经水适当稀释后，使用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见全波长扫描，结果未见最大吸收波长。因溶液呈现的颜色是溶液吸收光的互补色，德赢vwin登录 多糖水提物脱色前后、稀释前后均为黄棕色，可知溶液主要吸收蓝色波段的可见光。因此，选择处于该波段吸光度较大的450nm作为检测波长，并按如下公式计算多糖脱色率：多糖脱色率（％）＝（A1-4）／Ax100％（式中，4和4分别为德赢vwin登录 多糖水提物经大孔吸附树脂处理前、后在450nm波长处的吸光度）。

2.1.2 多糖质量浓度的测定及多糖保留率的计算 按2020年版《中国药典》（一部）中灵芝多糖含量测定项下的硫酸-蒽酮法处理德赢vwin登录 中多糖：使用使用紫外-可见分光光度计于625nm波长处测定吸光度（4），并根据回归方程A＝39.603c-0.077 1（R2＝0.9998）计算德赢vwin登录 多糖的质量浓度，并按如下公式计算多糖保留率：多糖保留率（％）＝o／c，x100％（式中．a和c2分别为德赢vwin登录 多糖水提物用大孔吸附树脂处理前、后德赢vwin登录 多糖的质量浓度）。该方法的方法学考察结果均符合2020年版《中国药典》（四部）的相关规定。

2.2 吸附脱色实验

2.2.1 大孔吸附树脂的预处理 AB-8大孔吸附树脂（类型据前期研究结果选择）用95％乙醇浸泡24h，倒去浮在水面的小颗粒树脂后，用水清洗至澄清、无醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％氢氧化钠溶液浸泡24h，用水清洗至中性，最后用水浸泡并封存，备用。