齐鑫鑫＇，由淑萍2，何转霞1，赵军3，刘涛

（新疆医科大学公共卫生学院：新疆医科大学护理学院；乌鲁木齐830011；新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830004）

摘要：目的探讨肉苁蓉苯乙醇苷（Cistache deserticola phenylethanoid glycosides，CPhGs）对HepG2 细胞增殖、凋亡的影响。方法实验以HepG2细胞为研究对象，采用MTT及平板克隆实验检测细胞增殖情况、Annexin V-FITC／PI、Hochest33258和线粒体染色法分析细胞凋亡、流式细胞术分析细胞周期，免疫印迹法检测Bcl-2、Cleaved-Caspase3及PARP表达情况。结果CPhGs可抑制HepG2细胞增殖，IC，为187μg／mL；平板克隆实验发现，CPhGs中、高剂量组对HepG2细胞有明显的抑制作用（P＜0.01）。通过倒置显微镜、细胞核及线粒体染色发现，CPhGs各组均可诱导HepG2细胞发生凋亡。同时，Annexin V／PI双染实验结果表明，CPhGs各组均诱导HepG2细胞发生早期凋亡（P＜0.01），且呈现一定的剂量依赖性；CPhGs各剂量组还可将HepG2细胞周期阻滞在S期（P＜0.01）。Western-blot结果显示，CPhGs可诱到凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase3及PARP表达的增加，同时还可抑制抗凋亡白Bcl-2的表达（P＜0.01）。结论CPhGs对HepG2细胞具有一定的抑制增殖、诱导凋亡的作用，其机制可能与调控细胞周期、诱导细胞凋亡相关蛋白表达有关。

关键词：肉苁蓉苯乙醇苷；HepG2肝癌细胞；细胞增殖；细胞凋亡；细胞周期

肝癌在全球都是严重的公共卫生问题。2018年，肝癌发病率在全球癌症发病率中排第6位，死亡率在全球癌症相关死亡率中排第2位，其中超过一半的新发病例和死亡病例在中国＂。传统的肝癌治疗方法存在许多局限，与化疗药物相比，天然药物因具有温和、毒副作用小、无耐药性的特点，能有效改善患者症状，提高生活质量，延长肿瘤患者生存期等独特的优势而逐渐得到广泛研究与应用。

肉苁蓉（Cistache deserticola）是我国传统的名贵补益类中药，自古就有“沙漠人参”的美誉。近年来，肉苁蓉以其显著的生物活性备受人们关注。其化学及药理作用研究显示，苯乙醇苷是肉苁蓉发挥药效的主要物质基础之一，它具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等多种生物活性。研究发现，其单体松果菊苷可通过降低氧化损伤、减轻肝脂肪病变来预防酒精引起的肝损伤，而类叶升麻苷可有效预防肝细胞癌的发生＂。已有研究发现类叶升麻苷可有效减缓酒精性肝损伤中的炎症反应；此外，CPhGs、松果菊苷与毛蕊花糖苷均具有良好的抗纤维化作用。因此，本实验旨在通过CPhGs调控HepG2肝癌细胞增殖、凋亡防治肝癌的实验研究进一步充实CPhGs在医药领域的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 HepG2肝癌细胞株（货号：ZQ0022，上海中桥新舟生物科技有限公司）。

1.1.2 药物与试剂 肉苁蓉苯乙醇苷（CPhGs，含松果菊苷≥35％，毛蕊花糖苷≥16％；批号：20180502，win德赢官方 ）；MEM不完全培养基（美国Gibeo公司）；胎牛血清（批号：1928702）、谷氨酰胺（批号：1941832）、丙酮酸钠（批号：1916979）；双抗（青霉素与链霉素）、细胞凋亡试剂盒与细胞周期试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；四甲基偶氮唑盐MTT（批号：EZ5679C133）、二甲基亚砜（DMSO与Hoechst33258（美国Sigma公司）。

1.1.3 仪器 超净工作台与全管波长自动酶联免疫反应检验测试仪（美国Themo Scientifie公司）；CO2细胞培养箱（英国NEW BRUNSWICK Galaxy系列）；CK-40影型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；AEL-200型电子天平；TGL-16G型台式低温高速离心机；低温离心机（美国Sigma公司）；数显恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 HepG2肝癌细胞用MEM完全培养基（含10％FBS、1％双抗、1％谷氨酰胺、1％丙酮酸钠），在37℃，5％CO2培养箱中培养，待细胞长至对数生长期实验。实验分为4组：空白对照组（完全培养基）、CPhGs低、中、高剂量组（含不同浓度CPhGs的完全培养基），并使用相差倒置显微镜拍照，观察不同浓度CPhGs对HepG2细胞形态的影响。

1.2.2 MTT法检测HepG2细胞增殖抑制的影响 取对数生长期的HepG2细胞，调整细胞密度为3x10个／孔，接种于96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，分别加入含0、78、110、125、150、170、188、220、375、500 μg／ml．CPhGs的完全培养基培养24h，加MTT溶液处理4h，再加人DMSO避光孵育10min，然后用酶标仪在490nm处检测吸光度值（OD值）。计算细胞半数抑制率（IC）并设置后续实验干预剂量。抑制率＝（空白对照组OD值-实验组OD值）／空白对照组OD值］x100％。

1.2.3 平板克隆实验观察CPhGs对HepG2肝癌细胞克隆率的影响 取对数生长期的细胞，以2000个／孔的细胞密度均匀的铺至六孔板中，细胞贴壁后，换含不同浓度的CPhGs完全培养基培养。7d后，弃上清，PBS洗涤2次，加入1mL4％组织固定液固定30min。30min后，弃去组织固定液，加入1mL结晶紫，染色30min，然后再用PBS洗涤细胞2次，室温晾干拍照。