1.2.4 倒置显微镜拍照观察CPbGs对HepG2细胞形态学的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，分别加入含0、32、64、128μg／mL．CPhGs的完全培养基培养24h后，在倒置显微镜下拍照观察细胞形态变化情况。

1.2.5 Hoechest33258检测CPhGs对HepG2细胞核的 影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／mL的细胞密度接种至4分格玻底皿中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集细胞用Hoechst33258稀释液染色15min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞核损伤情况。

1.2.6 线粒体染色检测CPhGs对HepG2细胞线粒体的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／ml的细胞密度接种至4分格玻底皿中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集细胞用线粒体染剂染色15min，然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞线粒体损伤的发生情况。

1.2.7 AnnexinV-FITCIPI 双染法观察CPhGs对 HepG2细胞凋亡率的影响 取对数生长期的HepG2细胞，以1x10个／mL的细胞密度接种于6孔细胞培养板中，分别加入含0、32、64、128μg／ml．CPbGs的完全培养基培养24h后，收集细胞根据调亡试剂盒说明逐步处理细胞，然后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.8 流式细胞术检测CPhGs对HepG2细胞周期的影响 HepG2细胞按“1.2.4”步骤接种至6孔板中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集细胞用预冷的75％乙醇中固定过夜，次日洗涤并收集细胞，按试剂盒说明书逐步处理细胞，然后采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.9 Western-blot 检测不同浓度CPhGs对HepG2细 胞凋亡蛋白Bd-2、Cleaved-Caspase3及PARP表达的 影响 HepG2细胞按“1.2.4”步骤接种至6孔板中，细胞分组处理同“1.2.4”实验。待细胞处理24h后，收集蛋白进行定量并使蛋白变性。根据目的蛋白分子量大小配置12％、10％的分离胶及5％的浓缩胶，每个样品按等质量上样，恒压电泳，恒流转膜，5％的脱脂牛奶室温封闭2h，4℃孵育一抗过夜，室温孵育二抗1h，曝光拍照，并用imag＝J进行条带灰度值分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS21.0统计软件进行统计分析，多样本均数比较采用方差分析，结果以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用LSD法，检验水准α＝0.05。

2 结果

2.1 CPhGs对HepG2细胞的增殖抑制作用 随着CPhGs药物浓度的增加，CPhGs对HepG2细胞的抑制逐渐增加，当CPhGs药物浓度为500μg／mL时，抑制率为（82±2.3）％，经过pobit分析，CPhGs对HepG2细胞的IC。为187μg／mL，见图1。在24、48、72h干预后，与空白对照组比较，CPhGs各剂量组OD值均显著降低，抑制率均显著增高，且差异均有统计学意义（P＜0.01）；干预24h后，CPhGs对HepG2细胞的增殖抑制具有一定的剂量依赖性（P＜0.01）。同时，比较CPhGs各剂量组在3个时间段的抑制率发现，CPhGs中、高剂量组，3个时间段HepG2细胞抑制率差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

图1 CPhGs对HepG2细胞的IC。

2.2 不同浓度CPhGs对HepG2肝癌细胞克隆率的影响 随着CPhGs药物浓度的增加，细胞克隆形成能力逐渐降低，当CPhGs为64μg／m与128μg／mL时，

注：A．空白对照组；B，CPhG低剂量组（32μg／mL）；C，CPhGs中剂量组（64μg／mL．）：D．CPhGs高剂量组（128μg／mL）右侧为不同剂量组细胞克隆率相对空白对照组的比值。与空白对照组比较，”P＜0.01图2 不同浓度CPhGs对HepG2细胞平板克隆率的影响

2.3 从形态学观察不同浓度CPhGs对HepG2细胞凋亡的影响 在不同浓度CPhGs处理组中，HepG2细胞随着药物浓度增高，细胞形态发生改变，细胞出现空泡，细胞折光度下降，细胞密度降低，细胞间连接疏松，细胞轮廓发生改变。CPbGs各剂量组干预24h后，细胞核出现染色质浓缩、核碎裂、核边集的细胞凋亡现象，并且细胞核发出的蓝色强光较空白对照组强。线粒体染色发现，CPhGs各剂量组细胞发生线粒体肿胀、碎片化、数量以及荧光强度都发生改变，且随着CPhGs剂量的增加，线粒体损伤特征也越来越明显。此外，还可以看出，CPhGs高剂量组的细胞数量下降明显，细胞皱缩。除了细胞核与线粒体发生明显改变外，细胞边界不清，处于即将崩裂、死亡的状态。

注：A.空白对照组；B.CPbGs低剂量组：C，CP％G中剂量组；D.CPhGs高剂量组

图3 不同浓度CPhGs诱导HepG2细胞凋亡的形态学现察（600x）

2.4 不同浓度CPhGs对HepG2细胞凋亡率的影响

注：a空白对照组：b，CPhGs低剂量：c．CPbGs中剂量：dCPbGs高剂量。与空白对照组比较，“P＜0.01，＂P＜0.05；

与低剂量组比较．P＜0.01；与中剂量比较，P＜0.01

图4 Annexin V-FITC／PI双染流式细胞术检测CPhGs对HepG2细胞凋亡的影响

2.5 不同浓度CPhGs对HepG2细胞周期的影响

胞比例，与空白对照组比较，GPhGs各剂量组均出现

G1期与G2／M期细胞比例，与空白对照组比较， 明显增加（P＜0.01）。此外，CPhGs各剂量组之间比CPhGs各剂量组均出现显著降低（P＜0.01）；而S期细 较，差异也具有统计学意义（P＜0.01）。见表2，图5。

表2 不同浓度CPhGs对HepG2细胞周期的影响（xts，n＝3）

注：与空白对照组比较，P＜0.01；与低剂量组比较，＊P＜001；与中剂量组比较，＊P＜0.01

注：a空白对照组：b，CPhGa低剂量：c，CPhGs中剂量；d，CPbGa高剂量

图5 不同浓度CPhGs对HepG2细胞周期的影响

凋亡是一种依赖蛋白酶的级联反应，它主要存在两种相互交错的途径：外在死亡受体途径和内在线粒体途径7，此外，还包含一些非经典途径，这些细胞凋亡途径大都依赖Caspase介导的级联反应。确定CPhGs诱导的细胞凋亡方式还需通过其他实验进行

综合判断。

目前，天然药物与肿瘤治疗的相关研究颇多，机制也复杂多样。因此，深入探讨CPhGs抑制HepG2细胞增殖、诱导HepG2细胞凋亡的具体分子学机制尤为重要，这为探讨防治肝癌的分子机制及肉苁蓉药物抗肝癌的研发提供一定的实验依据，也为新疆德赢vwin登录 药物的开发提供研究基础。