摘要: 为研究肉苁蓉苯乙醇苷对阿尔茨海默病模型小鼠海马β 淀粉样蛋白表达的影响。实验选用6 月龄APP/PS1双转基因AD 模型小鼠60 只，随机分为模型组、多奈哌齐组( 0． 65 mg /kg) 、肉苁蓉苯乙醇总苷剂量组( 250， 125， 62． 5mg /kg) 、肉苁蓉毛蕊花糖苷组( 125 mg /kg) ，正常组为同窝非转基因小鼠10 只，分别给予药物和蒸馏水灌胃3 个月，于9 月龄时通过Morris 水迷宫法检测行为学改变，采用HE 染色法观察小鼠脑部海马病变，采用免疫组化法和Western-blot 法考察海马Aβ1-42和Aβ1-40蛋白表达。实验结果发现肉苁蓉苯乙醇苷明显改善小鼠学习与记忆能力和脑部海马神经元的损伤，减少Aβ1-42、Aβ1-40阳性细胞数，并下调蛋白表达。肉苁蓉苯乙醇苷通过下调小鼠海马脑区Aβ1-42、Aβ1-40蛋白表达，从而影响Aβ 级联反应以保护神经元，发挥拮抗AD 作用。本研究明确了苯乙醇苷是肉苁蓉发挥抗AD 活性的主要药效物质基础，为后续将其开发为抗AD 新药提供了理论支撑。

关键词: 肉苁蓉; 苯乙醇苷; 阿尔茨海默病; APP/PS1 双转基因小鼠; β 淀粉样蛋白

阿尔茨海默病( Alzheimer disease，AD) 是一种以进行性记忆减退、认知功能障碍为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病［1-3］。目前较为公认的β 淀粉样蛋白( Aβ) 级联反应假说认为，生理状态下的正常代谢产物Aβ1-42和Aβ1-40单体本无神经毒性，但当其遇到APP 外源介质影响导致异常沉积后，积聚的Aβ1-42形成可溶性Aβ 寡聚体( ADDLs) ，阻止单体产生保护活性从而引起神经元变性、突触丢失和轴突损伤，最终引发脑内神经元凋亡致痴呆，因此考察其关键靶标Aβ1-42和Aβ1-40蛋白在脑内表达情况对于肉苁蓉苯乙醇苷防治的AD 研究具有重要的意义［4-7］。同时，研究AD 动物模型脑内特征性病变部位海马各分区的组织病理学检测可从宏观上真实反

映药物对其脑内病变部位的改善情况［8-10］。我国传统中医药认为补肾益精类中药肉苁蓉具有抗老防衰、改善记忆的功效［11-14］。大量前期研究已证实，肉苁蓉苯乙醇总苷及苯乙醇苷代表性单体-毛蕊花糖苷在传统方法构建的AD 在体或离体模型中均表现出明显的拮抗AD 作用，具有一定的防治神经退行性疾病的潜能［15-20］。但未见肉苁蓉苯乙醇苷应用APP /PS1 双转基因模型从β 淀粉样蛋白角度开展防治AD 作用研究。

综上所述，本研究基于AD 发病机制研究中经典假说—Aβ 级联反应假说，借助理想、可靠的AD动物模型APP /PS1 双转基因小鼠作为体内研究平台，采用Morris 水迷宫、HE 染色法、Western-blot、免疫组化等先进技术手段，从动物行为学、组织病理学角度、分子生物学层面考察肉苁蓉苯乙醇苷对APP /PS1 双转基因小鼠脑部海马区β 淀粉样蛋白表达的影响，以期寻找AD 防治新靶点，为肉苁蓉苯乙醇苷防治AD 具体作用机制的研究提供参考依据。

1 试药与仪器

1． 1 试药

肉苁蓉苯乙醇总苷( 课题组自制，苯乙醇总苷含量达87． 6%) ; 毛蕊花糖苷( 批号111530-200505，中检所) ; 二氧化钛( 批号20161025，上海染料研究所有限公司) ; HE 染色试剂盒( 批号20160902，凯基生物公司) ; 中性树胶( 批号20161208，上海懿详公司) ; SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒( 批号1043721，北京索莱宝公司) ; BCA 蛋白定量试剂盒( 批号20150323，南京凯基生物公司) ; Aβ1-40( 批号20161012，美国CST 公司) ; Aβ1-42

( 批号20161014，美国CST 公司) ; β-actin( 批号20161012，美国CST公司) ; 碱磷酶标记兔抗山羊IgG ( H + L) ( 批号20162308，北京中杉金桥公司) ; 4 × 蛋白上样缓冲液含β-巯基乙醇( 批号2010662，北京索莱宝公司) ; 10

× TBST( 批号20160611，北京索莱宝公司; PVDF 膜( 批号03010040001，瑞士罗氏公司) ; SDS ( 批号20160930，北京索莱宝公司) ; Tris ( 批号WXBB4339V，美国VETEC 公司) ; 甘氨酸( 批号GB10466，北京索莱宝公司) ; 脱脂奶粉( 批号WB20361，美国BD 公司) ; BCIP /NBT Kit( 美国invitrogen公司) ; 二抗( 批号15922207，北京中杉金桥公司) ; 吐温20( 批号WXＲC6526N，美国VETEC 公司) 。

1． 2 动物

6 月龄APP /PS1 双转基因AD 模型小鼠60 只及同窝阴性小鼠10 只，雌雄对半，体质量20 ± 10 g，中国江苏南京模式动物研究所，许可证号［SCXK( 苏) 2015-0001］，实验过程中动物自由摄食和饮水。

1． 3 仪器

MT-100 Morris 水迷宫( 成都泰盟科技有限公司) ; 凝胶成像仪( 美国BIO-ＲAD 公司) ; ＲM2016 病理切片机( 德国Leica 公司) ; SIM-F124 型制冰机( 日本SANYO 公司) ; 凝胶电泳及转膜设备( 美国BIO-ＲAD 公司) ; 全波长酶标仪( 美国Thermo Scientific公司) ; CO2恒温培养箱( 美国Thermo 公司) ; 4°C 和-20°C 冰箱( 青岛海尔公司) ; 67120 超纯水仪( 美国Millipore 公司) ; TP-114 电子天平( 北京Sartorius公司) ; 低温冷冻高速离心机( 美国Thermo Scientific公司) ; DVKW-D-2 数显电热恒温水浴锅( 北京市永光明医疗仪器厂) ; 超声波细胞破碎仪( 宁波新芝公司) ; WD-9405A 型脱色摇床( 北京六一仪器厂) ; 可调式恒压恒流电源( 美国BIO-ＲAD 公司) ;DM4000 荧光倒置显微镜( 德国Leica 公司) 。

2 方法

2． 1 动物分组与给药

依据SPSS18． 0 统计软件产生的随机数字，将AD 模型小鼠随机分为模型组、多奈哌齐组( 每日灌胃剂量为0． 65 mg /kg) 、肉苁蓉苯乙醇总苷( PhGs)高、中、低剂量组( 每日灌胃剂量分别为250、125、62． 5 mg /kg) 、肉苁蓉毛蕊花糖苷干预组( 125 mg /kg) ，每组10 只。于6 月龄时开始对小鼠按组别实施灌胃治疗，连续3 个月，每日灌胃1 次。正常组为同窝非转基因小鼠，模型组和正常组给予等体积蒸馏水灌胃。

2． 2 Morris 水迷宫实验

采用经典的Morris 水迷宫测试小鼠空间学习及记忆能力。第1、2 天训练小鼠熟悉平台位置，练习寻找平台，第3 ～ 5 天进行正式测试，观察各组小鼠训练后寻找平台的情况，第6 天撤去平台，观察小鼠的游泳轨迹。实验过程中，摄像头会同步记录小鼠寻找平台花费时间( 即逃避潜伏期) 及游泳轨迹的距离。若小鼠在设定的时间范围内未找到平台( 一般设定为60 s 或120 s，本实验采用60 s) ，则将该小鼠的逃避潜伏期记为设定值，且由工作人员将其置于平台上停留数秒( 本实验釆用10 s) ，助其加深平台记忆。实验结束后，记录小鼠从入水开始直至找到平台的游泳时间。在实验的最后一天，撤去平台，设定时间内需要记录的内容主要有小鼠穿越平台次数、目标象限的停留时间等，分析每个实验动物的搜索策略。

2． 3 脑组织取材及石蜡包埋

给药结束后称重小鼠，使用10% 水合氯醛麻醉小鼠。将麻醉后的小鼠仰放在操作台上固定四肢。4%多聚甲醛内灌注固定后处死动物，剔除小脑等多余的脑组织，沿大脑半球末尾，除去整个小脑和大脑中部冠状面前半部分。4%多聚甲醛中固定24 h，超纯水清洗10 分钟后依次放入30% 乙醇( 1 h) →40%乙醇( 1 h) →50% 乙醇( 1 h) →75% 乙醇( 1 h)→90%乙醇( 1 h) →95%乙醇( 1 h) →无水乙醇I( 1h) →无水乙醇II( 1 h) →二甲苯I( 15 min) →二甲苯II( 15 min) 。浸入石蜡2 h，组织包埋后在小鼠脑部海马CA1 区连续冠状切片。于60 ℃烘箱内干燥48h 后常温保存。

2． 4 HE 染色

将每组选取的切片于60 ° C 烘箱内烤片40min，然后依次将其放入二甲苯I( 5 min) →二甲苯II( 10 min) →无水乙醇( 5 s) →95% 乙醇I ( 5 s) →95%乙醇II( 5 s) →80%乙醇( 5 s) →蒸馏水冲洗多次，使用HE 染色试剂盒染色后中性树胶封片。

2． 5 免疫组织化学染色

将制备完成的切片按照脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化氢酶、血清封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB 显色、脱水、封片的标准步骤进行免疫组化染色。每组选取适宜6 张切片，电镜下观察神经元细胞形态、着色，使用Image J 软件计数海马阳性细胞数值。

2． 6 Western blot 分析蛋白表达情况

吸取组织上清液按照BCA 蛋白定量法测定从脑组织海马中提取的蛋白含量。与4 × 蛋白上样缓冲液按照4: 1 的比例混匀， 95 °C 加热10 min，自然冷却后于-20 °C 冰箱内保存。制备SDS-PAGE 凝胶，加入电泳液后依次加入正常组、药物干预组等各组蛋白，两侧胶孔加入蛋白Marker。冰浴盒中电泳至分离胶底部终止电泳。转膜液平衡后依据胶大小剪取PVDF 膜、滤纸。在转膜夹中按照黑色纤维垫→3 层滤纸→凝胶→PVDF 膜→3 层滤纸→黑色纤

维垫组装，清除气泡后80 V 恒压转膜。转膜完成后脱脂牛奶封闭2 h。稀释抗体加入对应膜中孵育过夜。二抗孵育2 h 后加入BCIP /NBT 显色液直至显色。BIO-ＲAD 凝胶成像仪采图。用Image J 软件定量分析目的蛋白条带，以IOD 表示蛋白条带的相对强弱。结果以目的蛋白与对照蛋白β-actin 的积分光密度值的比值表示。结果以( 目标蛋白ID/内参ID) × 100%表示。

2． 7 数据统计学分析

采用SPSS18． 0 进行数据的统计分析，数据以( 珋x ± s ) 表示，组间数据比较采用单因素方差分析( One-Way ANOVA) 检验分析，数据间的多重比较采用LSD-t 检验( least significant difference，LSD) ，以P＜ 0． 05 或P ＜ 0． 01 表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3． 1 Morris 水迷宫检测结果

随着训练时间的不断增加，各组小鼠到达平台的时间( 逃避潜伏期) 明显缩短。第1，2 天为训练时间，第3 天模型组与正常对照组小鼠相比逃避潜伏期显著延长( P ＜ 0． 01) ; 第4 天、第5 天模型组小鼠逃避潜伏期与正常对照组小鼠相比明显延长( P＜ 0． 05) ; 第3 天多奈哌齐组小鼠逃避潜伏期与模型组相比显著缩短( P ＜ 0． 05) ; 与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组、毛蕊花糖苷组随着剂量的增加，小鼠逃避潜伏期明显缩短，具有显著差异( P ＜0． 05) ( 见表1) 。

水迷宫实验第6 天撤去平台进行空间探索实验，记录60 s 内各组小鼠穿越平台位置的次数。由结果可得，模型组小鼠在设定时间内穿越平台次数与正常组小鼠相比显著减少( P ＜ 0． 01) ; 与模型组相比，肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组及毛蕊花糖苷组穿越平台次数明显增加( P ＜ 0． 05) ，具有显著性差异( 见表2) 。上述研究结果均暗示肉苁蓉苯乙醇苷可以显著改善APP /PS1 双转基因AD 小鼠的学习记忆能力，并且具有一定的剂量依赖性。

3． 2 病理组织染色观察结果

结果可知，正常组海马CA1 区神经元细胞排列整齐紧密，分布较为均匀，层次清晰，椎体细胞核较大且性状近似圆形。而模型组小鼠海马CA1 区由于受到损伤，导致神经元细胞和形态发生明显改变，排列疏松混乱，无明显层次，细胞之间的连接松散，部分细胞核出现固缩、凋亡，使染色偏深。肉苁蓉苯乙醇苷不同剂量干预组、多奈哌齐组和毛蕊花糖苷干预组海马CA1 区细胞均有不同程度的改善，固缩、深染的神经元细胞较模型组明显减少，但仍可看到较大的细胞间隙( 见图1) 。

3． 3 免疫组化实验结果

肉苁蓉苯乙醇苷治疗后，取9 月龄的APP /PS1双转基因小鼠脑部组织切片，对其海马CA1 区进行Aβ1-40免疫组化染色，结果显示: 视野内可见阳性细胞多呈圆形，大部分是胞膜着棕黄色，与正常组比较，模型组小鼠海马CA1 区Aβ1-40阳性细胞数明显增加( P ＜ 0． 01) ; 与模型组比较，肉苁蓉苯乙醇总苷高、中剂量组和毛蕊花糖苷组阳性细胞数显著减少( P ＜ 0． 01) ，多奈哌齐组和肉苁蓉苯乙醇总苷低剂量组Aβ1-40阳性细胞数明显减少( P ＜ 0． 05) ，具有显著性差异( 见表3，图2) 。经肉苁蓉苯乙醇苷干预后，取9 月龄的APP /PS1 双转基因小鼠脑组织切片，对其海马CA1 区进行Aβ1-42免疫组化染色，结果显示: 与模型组比较，肉苁蓉苯乙醇总苷各剂量组和毛蕊花糖苷组阳性细胞数显著减少，具有显著性差异( P ＜ 0． 01) ( 见表4，图3) 。