3． 4 Western-blot 检测结果

Western-blot 法检测小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42蛋白的表达，结果表明，模型组小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42的蛋白表达较正常组明显上调，有显著性差异( P ＜0. 05) 。肉苁蓉苯乙醇苷各剂量干预组和毛蕊花糖苷干预组小鼠海马Aβ1-40、Aβ1-42蛋白表达较模型组小鼠均显著下调( P ＜ 0． 01) ，具有显著性差异( P ＜0． 01) ，见图4。

4 结论

AD 主要发生在中枢神经系统，由多因素诱导产生，到目前为止其发病机制尚不明了，但研究核心仍然围绕Aβ 展开。作为脑内APP 分泌的主要多肽，Aβ1-42和Aβ1-40的异常沉积并不能直接引起神经元的变性，从病源的角度来讲，Aβ1-42产生的可溶性寡聚体ADDLs 才是导致脑内神经元变性的真正诱因。但对这两种蛋白表达的考察也可以实时反映AD 脑内病变程度，间接显示可溶性寡聚体ADDLs的表达情况，进而从源头动态监测脑内神经元损伤

状况，为疾病防治提供参考。也鉴于此，Aβ1-42和Aβ1-40已成为AD 发病机制研究中的关键靶标。海马作为脑内评价学习记忆能力优劣的主要作用部位，其神经元的损伤是AD 产生认知功能障碍的主导诱因，而海马CA1 区是AD 病理损伤的主要部位之一，本部分实验采用HE 染色法，结果发现正常组海马CA1 区神经元细胞排列整齐紧密，分布较为均匀，层次清晰。而模型组小鼠海马CA1 区因损伤出现神经元细胞凋亡等退行性改变，经肉苁蓉苯

乙醇苷不同剂量组干预后，其海马CA1 区细胞形态均有不同程度的改善，提示肉苁蓉苯乙醇苷可能具有保护神经元、抑制其凋亡的作用，但由于HE 染色对于细胞凋亡和神经元丢失并无特异性，后期仍需要针对凋亡特异分子标志物进行相关检测。

HE 染色法是组织病理学考察的经典方法，对待测组织的前处理直接关系到染色结果。实验中作者发现，由于转基因小鼠海马位于端脑颞叶的内侧深部，体积较小，组织分离难度较大，稍有不慎就会对其造成机械损伤，从而无法有效观察其病理改变。同时，因转基因小鼠价格昂贵，且实验给药周期较长，样本一旦损失可能影响研究的整体进度。因此，当小鼠完成心脏灌注后，全脑取出使用多聚甲醛固定，手术刀片除去嗅球部分，其余脑组织全部进行脱水、包埋步骤，切片厚度控制在3 ～ 5 μm，在保证海马体完整的前提下优化了操作流程，提高了研究效率。在Western-blot 检测中作者发现，由于Aβ1-42和Aβ1-40蛋白分子量较小，使表达条带不易印迹，因而需要对其SDS-PAGE 凝胶浓度、电泳时间和转膜时间进行筛选。分离胶浓度过小会导致电泳泳道迁移，蛋白激活不完全; 电泳时间过长会导致条带偏移出凝胶层; 相应的转膜时间过久则会使蛋白印迹模糊，从而影响一抗孵育和二抗结合。鉴于此，本研究经预实验摸索，最终选择15%分离胶，电泳和转膜2 小时对Aβ1-42和Aβ1-40进行蛋白印迹，考察其表达情况。目前在对蛋白调控所采用的技术手段中，Western-blot 法主要进行定量，考察相关蛋白具体表达

量。而免疫组化法则从定性角度出发，一方面更直

观的展现蛋白与抗体特异性结合程度，另一方面佐证定量结果。因免疫组化法是通过抗体与组织病理切片上的抗原位点结合来检测蛋白表达情况，所以组织病理切片的制作显得尤为重要。切片不易过厚，切片完成后应注意保存，避免组织切面受到外界损伤; 处理前应进行充分的脱蜡，时间不宜少于2 小时; 选择条件温和、附带损伤较小的柠檬酸缓冲液对抗原进行修复，去除过氧化氢酶，充分暴露抗原位点，使一抗与位点完全契合。以上两种方法作为分子生物学常用检测手段，相辅相成，为蛋白的调控研究提供了技术保障。

本研究借助HE 等方法对脑内海马病变情况、Aβ 相关蛋白表达进行了考察，结果显示，经肉苁蓉苯乙醇苷干预后，AD 模型小鼠脑内海马CA1 区细胞形态均有不同程度的改善，Aβ1-42和Aβ1-40的表达量明显下调，此外通过研究还发现毛蕊花糖苷干预组保护神经元作用优于苯乙醇总苷组，提示毛蕊花糖苷作为肉苁蓉苯乙醇苷代表性单体，相较于肉苁蓉苯乙醇总苷，其改善AD 模型鼠脑区病理改变进而发挥拮抗AD 作用潜能巨大，具体作用机制有待

后续进一步研究。本研究完善肉苁蓉从Aβ 角度拮抗AD 作用机制的研究资料的同时，为后期进一步阐明肉苁蓉有效组分或活性单体抗AD 作用机制奠定研究基础。

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