许伟＇，丁聚贤2”，谢兴文，李鼎鹏，李宁2，柳 博2，苏积亮2，李建国＇，宋学文2

（1．甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050：2．甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000；

3．西北民族大学附属医院，甘肃兰州 730000）

摘要：目的 探索肉苁蓉含药血清对人骨内瘤化疗耐药MG-63细胞的逆转作用及对多药耐药蛋白1（MRP1）和P53蛋自表达的影响。方法 通过内苁蒙水溶液灌胃SD大鼠获得高、中、低制量组的含药血清及空白组血清。粘壁培养法培养MG-63细胞，MTT法检测药物干预前MTX的C。值，将MG-63细胞分为高制量组（A）、中剂量组（B）、低剂量组（C）、空白组（N），采用ICm浓度的MTX分别干预各组贴壁细胞，24h后A、B、C组加入相应的内苁蒙含药血清，空白组加入对照组血清，持续干预至盐水组细胞在IC。浓度的MTX中稳定生长各组停止干预。MTT法检测各组细胞对MTX的对药倍数，流式细胞仪检测MRP1的表达，Westem blot检测P53蛋白的表达。结果 干预后A、B．C．N四组细胞耐药指数（RI）依次为：1.80.2.55、2.84、3.74；肉苁蒙含药血清干预后各组细胞MRPI的表达均下调，与空白组相比较有明显统计学差异（P＜0.001）；相比较于空白组，药物干预后各组P53蛋白表率达均下调，各组比较有统计学意义（P＜0.01）。结论 内苁蓉能有效逆转化疗耐药骨内瘤MG-63细胞的耐药性，其机制可能与下调MRPI及P53蛋白的表达有关。

关键词：骨肉瘤；化疗耐药；多药耐药相关蛋白1；P53蛋白；MG-63；肉苁蓉

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是临床最多见的原发恶性骨肿瘤，起源于间叶组织，多见于青少年，好发于股骨远端和胫骨近端，病死率高。Rown在1978年首次提出了辅助化疗联合手术切除的理念，近年来由于新辅助化疗理念的不断完善已将 OS患者5年生存率从20％提升至70％。OS治疗的成败需综合手术完整的切除与化疗敏感性综合评估，术前化疗可有利于瘤体完整的切除，肿瘤细胞对化疗药的耐药是导致术后局部复发与转移的最常见原因，因此，化疗的高敏感性对OS患者的预后及生存期有着重要的临床意义，而耐药是OS患者化疗失败最常见且 分析后得到IC值。最难解决的问题之一。近年来，中药因其低毒、多通路协同抗肿瘤的优势，研究者们对于中医药逆转肿瘤耐药性的研究了大量开拓性的研究，且部（N）组。取对数生长期的人骨肉瘤MG-63 细胞，胰酶消化后制分研究得到了佐证。大多扶正类药物如人参、黄芪等中药，备成悬液·调整密度为5x10°个，接种4小时后4组均加入含不仅可以提高自身免疫功能，同时也可以逆转肿瘤细胞的多药耐药，肉苁蓉可改善肿瘤化疗后造血和免疫功能低下，有增效减毒之效。06化疗抵抗的患者往往表现为免疫功能及造血功能的 培养至N组细胞可以在含MTX的培养液中稳定生长以后，各组低下，因此，本研究在体外试验的水平上，通过观察肉苁蓉含药血清对人骨肉瘤MG-63／MTX耐药细胞P糖蛋白（P-glycopo-2.4 MTT法检测药物干预后MG-63细胞对MTX的耐药指数tein，P-g）及多药耐药相关蛋白1（MDR-aswciated petein1．MRPI）的影响，初步探索肉苁蓉逆转骨肉瘤化疗耐药的分子机制。

1 材料与仪器

1.1 细胞株 MG-63细胞，购自上海中科院细胞研究所。

1.2 动物 SPF级SD大鼠D10周龄，体重（270±30）g］88只．购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号：62001000000427.

1.3 试剂 胎牛血清-0.25％ Trypsin-EDTA、高糖 DMEM培养基（Cellmas 公司，批号分别为：20161213.20171102、20170919）； 甲氨蝶呤（大连美仑生物技术有限公司，批号：15475-56-6）：肉苁蓉（甘肃天力士中天药业有限责任公司，批号：1802025），由甘肃数字草本检验中心有限公司鉴定；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司，货号：MA0198）：兔单克隆抗体P53抗体（abcam公司，批号：ab32389）：山羊抗兔（hiowasy 公司，批号：BE0101）：鼠抗人单克隆抗体 MRPI 抗体（Biolegend公司，批号：370104）。

1.4 仪器 MCO-5AC型细胞培育箱（日本三洋电机公司）：RT-6100型酶标仪（深圳雷社生命科学股份有限公司）：SW-CJ-1FD型超净台（苏州净化股份有限公司）：LMQ型高压蒸汽灭菌机（山东新华医疗器械有限公司）：TDZA-WS型低速离心机（长沙平凡仪器有限公司）；XK96-3型微量振荡器（姜堰市医疗器械有限公司）：PowaPo型凝胶电泳仪（美国Bo-ral公司）：ChemiDoeTM型凝胶成像分析仪（美国Bio-ad公司）。

物学功能有关，分为野生型和突变型［，野生型P53可将细胞周期阻滞到C。期·最终导致细胞的程序性死亡0，但因其不稳定的性质，极易突变，其半衰期仅20-30min，故不易被检测。突变后的P53基因的稳定性增加，同时半衰期延长到了2-12小时，容易被检测口。突变后的P53基因不但会导致肿瘤细胞的过度增殖，诱发肿瘤新生，而且会抑制正常的细胞色素C的释放［3．。在OS中，秦晓飞发现O5组织P53蛋白阳性表达率升高，与患者化疗敏感性降低及预后不良有关。Zhang ZF等认为OS细胞的迁移与恶性增殖度与P53密切相关，沉默P53基因可降低OS细胞的增殖与迁移率。MRP1基因与P-gp的功能相似，可借助耦合物谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶耦将化疗药物泵出胞外。已有的研究发现MRPI蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，与患者的预后相关，MRPI的表达与骨肉瘤的恶性程度及耐药性产生过程有着密切的关联，如屠重棋等通过对比正常骨组织和OS组织中 MRPI的表达，发现MRPI在OS中存在表达，且与恶性程度呈正相关。TmY等发现与人骨肉瘤MG63和HOS 耐药细胞中 CD133．MRPI．MDRI 均呈高表达。张洪泉等发现肉苁蓉多糖可以增强小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的抑制率。刘智勤发现肉苁蓉对抗环磷酰胺化疗S180小鼠有增效减毒之效。最新研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过诱导细胞调亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，提高了肿瘤小鼠的存活率。

现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗氧化、抗衰老，保肝、保护心肌、抗肿瘤等作用，本次研究发现肉苁蓉在体外水平具有有逆转人骨肉瘤化疗MG-6细胞对MTX的耐药作用，机制可能与肉苁蓉下调MRPI及P53蛋白的表达水平有关，且下调水平与药物浓度呈正相关。但参与05产生化疗抵抗的机制较多，如DNA损伤修复学说-酶系统介导的耐药、自噬等·因此肉苁蓉逆转化疗MG-63细胞的耐药性是否与其他机制参与有待进一步研究。

3.1 各组细胞MTX药敏测定 与正常MG-63细胞相比，各组药物干预后的耐药细胞对MTX的IC均升高（表1）；与N组相比，药物干预后的三组细胞对MTX的C。降低，A组明显低于空白组。各组耐药指数（RD分别为：1.80、2.55、2.84、3.74。

表1各组人骨内瘤MG-63细胞IC50测定（ょ）

2.2 药物于预前MTT法测定MTX对MG-63细胞的IC。MG-63细胞在25c㎡的透气培养瓶贴壁培养·隔48b用含10％FBS的H-DMEM培养基换液，5％CO，37℃恒温培养箱中培养。取处对数生长期的MG-63细胞，胰酶消化，调整密度至4x10／ml的单细胞悬液，按照MTX的梯度浓度（20,5,0.5，0.05,0.005.0）pg＊ml接种6组细胞到96孔板，每个浓度设5复孔，每孔180μl．4h后依次加入各浓度的MTX，48小时后各孔加入20μl MTT（5mg＊L-＇）．4h后弃孔内废液，各孔加入200μl DMSO，摇床上震荡．10min后96孔板于全自动酶标仪上检测各孔560mm的吸光度，重复3次。计算各浓度下 比较有统计学差异（P＜0.01）。见图1，表2．MTX对MG-63细胞的抑制率，以药物浓度和抑制率做回归 3.3 各组细胞P53蛋白的表达结果 与空白组相比，肉苁蓉含药

3.2 各级细胞MRPI蛋白的表达结果 与空白组相比，肉苁蓉含药血清干预后各组MG-63细胞中 MRPI 蛋白表达率明显降低，有显著统计学差异（P＜0.001）；同时，MRPI蛋白的表达与肉苁蓉含药血清浓度呈负相关，A组MRPI的表达最低，与B组，C组

物学功能有关，分为野生型和突变型［，野生型P53可将细胞周期阻滞到C。期·最终导致细胞的程序性死亡0，但因其不稳定的性质，极易突变，其半衰期仅20-30min，故不易被检测。突变后的P53基因的稳定性增加，同时半衰期延长到了2-12小时，容易被检测口。突变后的P53基因不但会导致肿瘤细胞的过度增殖，诱发肿瘤新生，而且会抑制正常的细胞色素C的释放［3．。在OS中，秦晓飞发现O5组织P53蛋白阳性表达率升高，与患者化疗敏感性降低及预后不良有关。Zhang ZF等认为OS细胞的迁移与恶性增殖度与P53密切相关，沉默P53基因可降低OS细胞的增殖与迁移率。MRP1基因与P-gp的功能相似，可借助耦合物谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶耦将化疗药物泵出胞外。已有的研究发现MRPI蛋白的表达率与多种肿瘤细胞的耐药性相关，与患者的预后相关，MRPI的表达与骨肉瘤的恶性程度及耐药性产生过程有着密切的关联，如屠重棋等通过对比正常骨组织和OS组织中 MRPI的表达，发现MRPI在OS中存在表达，且与恶性程度呈正相关。TmY等发现与人骨肉瘤MG63和HOS 耐药细胞中 CD133．MRPI．MDRI 均呈高表达。张洪泉等发现肉苁蓉多糖可以增强小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的抑制率。刘智勤发现肉苁蓉对抗环磷酰胺化疗S180小鼠有增效减毒之效。最新研究发现肉苁蓉苯乙醇苷可通过诱导细胞调亡和细胞周期阻滞提高黑色素瘤荷瘤小鼠生存期，提高了肿瘤小鼠的存活率。

现代研究表明，肉苁蓉具有提高免疫力、抗氧化、抗衰老，保肝、保护心肌、抗肿瘤等作用，本次研究发现肉苁蓉在体外水平具有有逆转人骨肉瘤化疗MG-6细胞对MTX的耐药作用，机制可能与肉苁蓉下调MRPI及P53蛋白的表达水平有关，且下调水平与药物浓度呈正相关。但参与05产生化疗抵抗的机制较多，如DNA损伤修复学说-酶系统介导的耐药、自噬等·因此肉苁蓉逆转化疗MG-63细胞的耐药性是否与其他机制参与有待进一步研究。