谢乾，宋佳，万鹏，王清鹤，芦梓楠，孟馥芬＾

新疆医科大学附属肿瘤医院麻醉科新疆乌鲁木齐 830000

［摘要］目的 研究肉苁蓉总苷（GCs）对脂多糖（LPS）诱导的BV2细胞炎症反应的机制。方法 采用小鼠小胶质细胞BV2细胞株作为研究对象。将BV2细胞随机分为对照组、LPS组和GCs组。对照组正常培养。LPS组用 LPS诱导BV2细胞建立炎症模型。GCs组加入不同浓度GCs与LPS共培养。CCK8检测各组细胞活性。qRT-PCR检测各组炎症因子IL-1β、COX-2 mRNA的表达，WB检测SIRT1、NF-KB蛋白水平的变化。结果 CCK8结果显示，GCs各组细胞活性与对照组之间无差异（P＞0.05），LPS组细胞活性显著低于对照组和GCs各组（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示，LPS组IL-1β、COX-2 mRNA表达水平显著高于对照组和GCs与LPS共孵育组（P＜0.05）。WB结果表明与对照组和GCs各组相比，LPS组SIRT1表达下调（P＜0.05），磷酸化p65的表达上调（P＜0.05）。结论 GCs能够抑制LPS诱导的BV2细胞的炎症反应，其机制可能与SIRT1／NF-KB信号通路相关。

［关键词］肉苁蓉总苷；脂多糖；BV2细胞；SIRT1／NF-KB

DOI:10.19668/j.cnki.issn1674-0491.2021.S1.0053

围术期神经认知紊乱（perioperative neurocognitive disorders，PND）与神经 炎症反应密切相关，高龄、手术创伤应激、麻醉药物等均可能诱发神经炎症反应，小胶质细胞活化是其重要的推进过程，在PND的发生和发展中发挥重要的作用。

肉苁蓉总苷（general cistanosides，GCs）的化学成分主要包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类等，具有明确的抗氧化和神经保护作用2,3］。本实验以LPS诱导的BV2细胞炎症反应模型为基础，采用GCs干预，通过检测IL-1β、COX-2、SIRT1、NF-KB-p65的变化，研究GCs对围术期神经炎症的影响，为肉苁蓉的进一步开发应用提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠小胶质细胞株（BV2）由上海复旦大学附属肿瘤医院朱敏敏教授惠

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组

BV2细胞以高糖DMEM＋10％FBS为细胞培养基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养。BV2 细胞随机分为对照组、LPS 组和不同浓度 GCs组。将LPS加到96孔板中，使其终浓度为1ug／mL，依据分组加入不同浓度的GCs，与LPS共培养。

1.2.2 CCK8检测细胞活性

细胞接种于96孔板，待贴壁后更换培养基，不同浓度GCs（5ug／mL、25 ug／mL、50ug／mL、75 ug／mL）和终浓度为1ug／mLLPS共培养，加入CCK8，酶标仪测定吸光度值并计算细胞活性。

1.2.3 qRT-PCR检测各组炎症因子IL-1β、COX-2的mRNA表达

1.2.4 WB 检测各组SIRT1、NF-KB-p65蛋白表达情况

按照说明书提取蛋白，电泳，转膜，一抗孵育，加入二抗，采用化学发光法进行显影，运用ImageJ软件分析灰度值。1.3 统计学方法

采用 SPSS19.0 软件进行统计分析，计量资料采用均数加减标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 GCs对BV2细胞活性的影响

同对照组相比，不同浓度的GCs对BV2细胞的活性未见明显的影响。结果见图1。

图1 GCs对BV2细胞活性的影响

2.2 GCs对LPS诱导的BV2细胞活性的影响

结果表明，与对照组相比，LPS组细胞活性明显降低（P＜0.01）；与LPS组相比，GCs组的细胞活性明显升高（P＜0.05）。结果见图2。

与对照组相比＊P＜0.05；与LPS组相比＃P＜0.05。图2 GCs和LPS对BV2细胞活性的影响

2.3 GCs对LPS诱导BV2细胞炎症因子IL-1β，COX-2mRNA表达的影响qRT-PCR结果表明，与对照组相比，LPS组中IL-1β，COX-2的mRNA表达明显提高（P＜0.05）。GCs与LPS共孵育各组炎症因子的mRNA的表达显著下降（P＜0.05）。结果见图3。

PND是常见的中枢神经系统并发症。目前认为神经系统炎症是PND的主要发生机制之一。手术应激、全麻药物、衰老等可诱发神经系统炎症触发并加重 PND。因此，围术期神经保护、神经系统炎症管理可能有助于改善PND。

目前研究表明，GCs中的松果菊苷、毛蕊花糖苷等成分具有明确的抗氧化及神经保护的作用，但具体机制尚不明确。本研究以BV2为研究对象，在细胞水平探讨了GCs对NF-kB信号通路的影响。实验结果表明，本实验采用的GCs浓度对细胞活性没有影响，LPS组细胞活性降低及炎症因子增加表明神经炎症造模成功，LPS与GCs共同孵育的结果表明GCs可以改善炎症状态下的细胞活性。

SIRT1 是一种进化高度保守的NAD＋依赖性蛋白去乙酰化酶，与炎症反应密切相关。2004年Yeung 等人的研究［4］首次证实SIRT1可与NF-KB的RelA／p65 亚基相结合影响 NF-KB的转录活性，抑制 NF-KB 介导的炎症信号通路。本研究结果发现 LPS 诱导的 BV2 细胞中 SIRT1 表达降低，NF-kBp-65的磷酸化水平升高，下游炎症因子的表达增加。GCs与LPS共孵育组细胞内SIRT1表达上调，NF-kBP65的磷酸化水平下降，下游炎症因子的表达减少。结合上述实验结果，我们推测GCs可能通过激活BV2细胞中的SIRT1／NF-KB信号通路来抑制炎症因子的表达。本实验的不足之处是未研究GCs对经SIRT1抑制剂处理后的细胞中的炎症介质产生的影响。这有待于我们下一步进行探究。

综上，我们的研究表明：GCs可能通过激活SIRT1／NF-KB信号通路，进而抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症反应，为后期开发肉苁蓉在神经炎症相关疾病的应用提供了参考。