摘要: 目的探讨肉苁蓉对卵巢早衰大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响及其作用机制。方法按照体重将SD 大鼠随机分为5 组: 正常组、模型组和低、中、高3 个剂量实验组，每组10 只。用雷公藤多苷50 μg·g － 1给予大鼠制备卵巢早衰大鼠模型。低、中、高3 个剂量实验组分别给予5， 10， 20 g·kg － 1 肉苁蓉。用酶联免疫吸附法检测大鼠促卵泡激素( FSH) 、雌激素和抗苗勒管激素( AMH) 水平; 以实时定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子－ α( TNF － α) 和干扰素－ γ( IFN － γ) 的基因相对表达水平; 以免疫印迹法检测B 淋巴细胞瘤－ 2( Bcl － 2)和B 淋巴细胞瘤－ 2 相关X 蛋白( Bax) 蛋白相对表达水平。结果正常组、模型组和低、中、高3 个剂量实验组的FSH 水平分别为( 16. 42 ± 1. 76 ) ，( 31. 83 ± 2. 67) ，( 25. 89 ± 2. 48) ，( 23. 73 ± 2. 05) 和( 21. 55 ± 2. 94) U·L － 1 ; 上述这5 组的雌激素水平分别为( 97. 64 ± 7. 85) ，( 53. 47 ± 6. 98) ，( 89. 56 ± 7. 28) ，( 93. 35 ± 6. 29) 和( 92. 45 ± 5. 60) ng·L － 1 ; 上述这5 组的AMH 水平分别为( 280. 84 ± 22. 42) ，( 149. 35 ± 14. 57) ，( 231. 71 ± 27. 38) ，( 253. 33 ± 27. 36) 和( 265. 64 ± 25. 34) pg·mL － 1 ; 上述这5 组的TNF － α 基因的相对表达水平分别为1. 00 ± 0. 00， 3. 54 ± 0. 35， 2. 41 ± 0. 27， 2. 32 ± 0. 25 和2. 13 ± 0. 21; 上述这5 组的IFN － γ 基因的相对表达水平分别为1. 00 ± 0. 00，4. 45 ± 0. 98，2. 93 ± 0. 31，2. 85 ± 0. 29和2. 67 ± 0. 26; 上述这5 组的Bcl － 2 蛋白的相对表达水平分别为0. 72 ± 0. 05， 0. 28 ± 0. 04， 0. 42 ± 0. 04， 0. 51 ± 0. 06 和0. 64 ± 0. 07; 上述这5 组的Bax 蛋白的相对表达水平分别为0. 48 ± 0. 04，1. 05 ± 0. 07，0. 86 ± 0. 08，0. 69 ± 0. 07和0. 53 ± 0. 06。模型组与正常组比较，或者低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) 。结论肉苁蓉能够调控FSH、雌激素和AMH 的水平，抑制TNF － α 和IFN － γ 基因的表达，其可能通过调控性激素因子及Bcl － 2 /Bax 蛋白的平衡从而影响卵巢早衰。

关键词: 肉苁蓉; 卵巢早衰; 免疫因子; B 淋巴细胞瘤－ 2; B 淋巴细胞瘤－ 2 相关X 蛋白

卵巢早衰( premature ovarian failure，POF) 是指卵巢内激素水平不平衡导致的卵巢功能障碍［1］。卵巢颗粒细胞的凋亡和细胞免疫因子均与POF 的发生密切相关［2］。肉苁蓉( CistanchesHerba，CH) 可以通过清除胚胎体外培养产生的自由基，提高胚胎体外发育率［3］。本实验研究肉苁蓉对POF 大鼠免疫因子和凋亡相关蛋白的影响及其作用机制。

材料与方法

1 材料

动物SPF 级12 周龄的SD 雌性大鼠，体重250 g左右，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。动物许可证号: SCXK( 沪) 2007 － 0005。药品与试剂肉苁蓉药材，购自承德医学院附属医院附属中药房同济大药房药剂科，经陕西中医药大学丁延平教授鉴定确为肉苁蓉，参考杨志蓉等［3］方法，制成剂量为50 mg·mL － 1 肉苁蓉溶液) 。实时荧光定量聚合酶链反应( qＲT － PCＲ) 试剂盒，购自南京Vazyme 生物公司; 免疫组化所用试剂，购自福州迈新公司; 二辛可酸( BCA) 试剂盒，购自碧云天生物技术研究所。仪器荧光显微镜，德国ZIESS 公司产品;Multiskan MK3 酶标仪，美国Thermo 公司产品。

2 实验方法

2. 1 POF 大鼠模型的制备［4］

大鼠用雷公藤多苷50 μg·g － 1 连续灌胃14 d，建立POF 大鼠模型。

2. 2 分组与给药［3 － 4］将造模成功大鼠随机分为4 组: 模型组和低、中、高3 个剂量实验组，每组10 只。10 只正常SD 大鼠作为正常组。于造模结束后24 h，低、中、高3 个剂量实验组分别给予5，10，20 g·kg － 1肉苁蓉，连续灌服20 d。模型组与正常组大鼠自由饮水。自中药灌胃第11 天起，每日进行大鼠阴道脱落细胞涂片观察，连续10 d，观察并记录大鼠动情周期。

2. 3 以酶联免疫吸附法( ELISA) 检测促卵泡激素( FSH) 、雌激素和抗苗勒管激素( AMH) 水平［4］分组与处置见“2. 2”。大鼠于间情期，腹主动脉取血，静置30 min，以3000 r·min － 1 离心，取上清液，按照ELISA 试剂盒说明书要求，于酶标仪450 nm 波长处测定光密度( OD) 值，即代表FSH、雌激素和AMH水平。

2. 4 以qＲT － PCＲ 测定肿瘤坏死因子－ α( TNF － α) 、干扰素－ γ( IFN － γ) 、B 淋巴细胞瘤－ 2( Bcl －2) 和B 淋巴细胞瘤－ 2 相关X 蛋白( Bax) 基因的表达水平［5］分组与处置见“2. 2”。提取卵巢组织总ＲNA，逆

转录成cDNA 后，按照qPCＲ 说明书进行qＲT － PCＲ扩增。循环条件: 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s; 72 ℃ 30 s，共40 个循环; 60 ℃ 延长5 min; 基因的相对表达量用2 －△△Ct法计算。

2. 5 以免疫印迹法检测Bcl －2 和Bax 蛋白表达［5］分组与处置见2. 2。提取各组卵巢组织蛋白，定量。按照文献方法操作。成像后，用Quantity One 凝胶分析软件处理，测定各组蛋白条带的OD 值，以目的条带和β － actin 条带的比值作为蛋白表达水平。

2. 6 以免疫组化染色检测TNF － α 和IFN － γ 蛋白表达水平［4］

分组与处置见“2. 2”。腹主动脉取血后，即刻剖腹取卵巢，置于4%多聚甲醛液中固定24 h，脱水后石蜡包埋，切片脱蜡，蒸馏水洗2 min，抗原修复，滴加H2O2阻断内源性过氧化物酶，再用血清封闭，清洗3次后，加入一抗孵育30 min 后，4℃过夜。再加酶标二抗，37 ℃孵育20 min; 加二氨基联苯胺显色，苏木素复染，脱水后封片，显微镜下观察染色结果。以TNF － α及IFN － γ 表达的积分OD 值代表其蛋白表达水平，每张切片随机取5 个视野。

3 统计学处理

用SPSS 20. 00 进行统计学分析。计量资料以珋x ± s表示，2组间比较用t 检验，多组间比较用单因素方差分析。

结果

1 肉苁蓉对大鼠性激素FSH、雌激素和AMH 水平的影响模型组与正常组比较，FSH 水平明显增加，而雌激素和AMH 水平明显降低，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表1。可见，肉苁蓉可降低FSH 的水平，提高雌激素和AMH 的水平。

2 肉苁蓉对大鼠TNF － α 和IFN － γ 基因表达的影响

模型组与正常组比较，TNF － α 和IFN － γ 基因表达水平均明显增加，差异均有统计学意义( 均

P ＜0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表2。可见，肉苁蓉可抑制TNF － α、IFN － γ 基因的表达。3 肉苁蓉对大鼠TNF － α 和IFN － γ 蛋白的影响模型组与正常组比较，TNF － α 和IFN － γ 蛋白表达水平均明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表3。可见，肉苁蓉可抑制TNF － α 和IFN － γ 蛋白的表达。

4 肉苁蓉对大鼠卵巢Bcl －2 和Bax 基因表达的影响模型组与正常组比较，Bcl － 2 基因的表达明显降低，Bax 基因的表达明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见表4。可见，肉苁蓉可促进Bcl － 2 基因的表达，却抑制Bax 基因的表达。

5 肉苁蓉对大鼠卵巢Bcl － 2、Bax 蛋白表达和Bcl －2 /Bax比值的影响模型组与正常组比较，Bcl － 2 蛋白表达水平和Bcl － 2 /Bax 的比值均明显降低，而Bax 蛋白表达水平明显增加，差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ; 低、中、高3 个剂量实验组与模型组比较，上述指标的差异均有统计学意义( 均P ＜ 0. 05) ，见图1 和表5。可见，肉苁蓉可促进Bcl － 2 蛋白的表达，抑制Bax 蛋白的表达，提高Bcl － 2 /Bax 的比值。

讨论

卵巢早衰大鼠中IFN － γ 的水平明显升高［6］。本研究结果发现，低、中、高3 个剂量实验组大鼠性激素FSH 含量显著降低，雌激素、AMH 含量显著升高;TNF － α、IFN － γ 和Bax 表达显著降低; Bcl － 2 表达水平显著升高，而Bcl － 2 /Bax 的比值显著升高。由此可见，肉苁蓉可以通过调节大鼠性激素水平，抑制TNF － α 和IFN － γ 的表达来减少卵泡闭锁和细胞凋亡，进而减缓卵巢衰竭速度; 肉苁蓉还可以上调Bcl － 2 /Bax。表明肉苁蓉有抑制卵巢早衰的作用，其机制可能与卵巢的性激素水平、TNF － α、IFN － γ 及凋亡相关蛋白Bcl － 2 /Bax 表达有关。

参考文献:

［1］ 崔合香. 中医分期用药治疗卵巢早衰的临床疗效观察［J］. 中国中医药科技，2019，26( 1) : 129 － 130.

［2］ 梁嘉丽，邝兆民，杨静，等. 补肾阴及补肾阳法对化疗诱导的卵巢早衰大鼠外周血TNF － α、IFN － α 水平及卵巢颗粒细胞凋亡的影响［J］. 中国病理生理杂志，2017，33( 1) : 139 － 142.

［3］ 杨志蓉，朱桂玉，甘世祥，等. 肉苁蓉水提液对猪早期体外发育胚胎中NO 剂量含量的影响［J］. 实验动物科学，2007，24 ( 4) :27 － 29，39.

［4］ 张丽娜，郑锦，刘特，等. 补肾活血方对卵巢早衰模型大鼠性激素水平及颗粒细胞凋亡调控相关因子的影响［J］. 上海中医药杂志，2015，49( 7) : 72 － 76.

［5］ 梁策，高慧，张腾. 补肾调冲方对卵巢早衰大鼠性激素水平和卵巢Bcl － 2 /Bax 表达的影响［J］. 中国实验方剂学杂志，2016，22( 19) : 100 － 104.

［6］ 高慧，杨涓，夏天，等. 补肾调冲方对卵巢早衰大鼠卵巢相关细胞因子TNF － α， IFN － γ 表达的影响［J］. 国医论坛，2008，23( 2) : 35 － 37.