摘要: 目的探讨肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响。方法54 只SD 大鼠随机分为正常组、模型组、肉苁蓉多糖组。除正常组外，其他组建立气管切开插管留置大鼠模型。造模6 小时后肉苁蓉多糖组用肉苁蓉多糖灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃，均每日1 次。造模后第24 小时、72 小时、168 小时三个时段取材，并检测大鼠肺组织β － 防御素－ 2( rBD2) mＲNA 表达、肺泡灌洗液分泌性免疫球蛋白A( sIgA) 及外周血IL － 2、IL － 6 的含量。结果( 1) 与正常组比较，模型组大鼠rBD2 mＲNA 表达在气管切开插管留置第24 小时明显升高，随后明显下降，第168 小时降到最低点( P ＜ 0． 05) 。与模型组比较，肉苁蓉多糖组大鼠rBD2 mＲNA 表达在第24 小时降低，第72 小时、168 小时明显升高( P ＜ 0． 05) 。( 2) 与正常组比较，模型组大鼠肺泡灌洗液sIgA 含量在气管切开插管留置第24 小时明显升高( P ＜0． 05) ，在第72 小时开始下降，逐渐回落至正常组水平。与模型组比较，肉苁蓉多糖组大鼠sIgA 含量在第72 及168 小时明显升高( P ＜ 0． 05) 。( 3) 与正常组比较，模型组大鼠IL － 2 含量在第72 小时升高( P ＜ 0． 05) ，其余时间段无明显改变( P ＞ 0． 05) 。与模型组比较，肉苁蓉多糖组大鼠IL － 2 含量在第24 小时即明显升高，第72 小时继续升高，在第168 小时达到高峰。( 4) 与正常组比较，模型组大鼠IL － 6 含量在第24 小时出现明显升高( P ＜ 0． 05) ，在第72 小时稍有下降，在

第168 小时无明显变化( P ＞ 0． 05) 。与模型组比较，肉苁蓉多糖用药大鼠外周血IL － 6 水平在第24 小时即显著降低，随后逐渐降低，至第168 小时达最低值( P ＜ 0． 05) 。结论肉苁蓉多糖能够改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。

关键词: 肉苁蓉多糖; 气管切开插管; 肺部免疫功能; β － 防御素－ 2

作为肉苁蓉的主要有效成分，肉苁蓉多糖具有调节内分泌［1］、增强吞噬细胞活性、促进淋巴细胞增殖［2］、抗氧化、抗衰老［3］等诸多药理作用。我们前期研究发现，补肾阳中药肉苁蓉能够提高气管切开插管留置大鼠肺泡灌洗液肺泡表面活性物质相关蛋白A( SP － A) 的浓度，减轻肺部病理改变［4］。然而，关于肉苁蓉多糖对肺部免疫功能的影响目前尚未见相关报道。因此，本课题试图通过动态观察大鼠肺组织rBD2、肺泡灌洗液sIgA 及

外周血IL － 2、IL － 6 等指标，探讨肉苁蓉多糖对气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能的影响。

1 材料与方法

1． 1 主要试剂和仪器提取总ＲNA 试剂盒、逆转录试剂盒及PCＲ 试剂盒均购自TAKAＲA 公司。IL － 2、IL － 6 、sIgA，ELISA 试剂盒均购自上海源叶生物科技有限公司; 肉苁蓉多糖( 批号:C23J7Y18405) 购自上海源叶生物科技有限公司。酶标仪( Model550 BIO ＲAD，美国BIO － ＲAD 公司) ，分光光度计( NanoDrop，T小时ermo Scientific 公司，美国) ，Ｒeal － Time PCＲ 仪( FAST7500，美国AB 公司) 。

1． 2 实验动物及分组54 只雄性SPF 级SD 大鼠，体重( 250 ±20) g，均由广西医科大学实验动物中心提供( 动物生产许可证号: SCXK 桂2014 － 0002，动物使用许可证号SYXK 桂2014 －0003) 。将大鼠随机分成正常组、模型组、肉苁蓉多糖组，每组18只。模型组和肉苁蓉多糖组大鼠均建立气管切开插管大鼠模型，

正常组大鼠不作处理。

1． 3 气管切开插管大鼠模型的制备采用一次性硬膜外麻醉导管制作气管切开插管留置大鼠模型［5］。大鼠称重，麻醉后，暴露气管，作一“V”字型切口，将导管送入气管中约15 ～ 20mm，缝合消毒。气管外预留导管15 ～ 20mm，绑线固定; 定时检测导管与外界通气情况以及导管内分泌物情况，确保其通气良好，定时消毒切口。

1． 4 给药剂量与方法用温水将肉苁蓉多糖粉末状溶解成含药浓度为3． 492ng /mL 的肉苁蓉多糖水溶液。参照徐叔云［6］《药理实验方法学》换算动物剂量公式计算得出每只大鼠给药剂量为50mg /( kg·d) 。因此肉苁蓉多糖组大鼠给予肉苁蓉多糖水溶液灌胃，剂量3mL/d; 正常组及模型组大鼠予以等量生理盐水灌胃，均每日1 次，连续7 天。

1． 5 取材分别于造模成功后24 小时、72 小时、168 小时，每组各取6 只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠( 3． 5mL/kg) ，麻醉成功后，经腹主动脉采血3mL，置于普通干燥管中，用于测定血清IL － 2 和IL － 6 水平。取材时结扎右肺，于左肺取肺泡灌洗液，用5mL 冰冻灭菌生理盐水灌洗，反复灌洗3 次，回收约3mL;上述过程重复3 次，共回收9mL，用于检测肺泡灌洗液sIgA 含量; 在4℃，离心10min( 2400 r /min) ，取上清液，置于－ 20℃冰箱中保存。开胸，取右肺中叶组织100mg，分装，迅速置于液氮中，后转移至－ 80 ℃冰箱中保存，用于测定肺组织rBD2 mＲNA 表达。

1． 6 观察指标与检测rBD2 mＲNA 水平的测定: 取肺组织标本，研碎，加入ＲNA 提取试剂ＲNAiso PLUS，按说明书提取肺组织总ＲNA; 然后进行逆转录合成cDNA，通过检索基因库，设计并合成出引物( 引物序列见表1) ，由实时荧光定量PCＲ 扩增，并检测rBD2 mＲNA 的相对表达量。

肺泡灌洗液sIgA、外周血IL － 6、IL － 2 含量的测定: 均采用多抗体夹心法ELISA 法检测。按照试剂盒说明书进行检测。

1． 7 统计学方法采用SPSS 22． 0 统计软件进行数据分析，计量资料以珋x ± s 表示，满足正态分布和方差齐性资料，采用单因素方差分析( one － way ANOVA) ，组间两两比较采用LSD 法、Dunnett＇3 法，以P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2． 1 大鼠肺组织rBD2 mＲNA 相对表达量( 2 －△△CT ) 正常组大鼠肺组织rBD2 mＲNA 相对表达量在3 个时间段无统计学差异。与正常组比较，气管切开后，大鼠肺组织rBD2 mＲNA 相对表达量第24 小时明显升高，随后开始下降，至第72 小时表达明显降低，降低程度随着时间延长而逐渐加重，在第168 小时表达下降到最低值( P ＜ 0． 05) 。用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠rBD2 mＲNA 表达量第24 小时表达明显下降，随后逐渐上升，在第168 小时达到最高值( P ＜ 0． 01) 。说明气管切开后，大鼠肺组织rBD2 mＲNA 的表达量立即升高，但随后随时间逐渐下降; 肉苁蓉多糖能够在第168 小时对气管切开插管留置后大鼠肺组织rBD2 mＲNA 的表达起明显促进作用。见表2。

2． 2 大鼠肺泡灌洗液sIgA 含量正常组大鼠肺泡灌洗液sIgA 水平在3 个时间段无明显变化。气管切开后，大鼠肺泡灌洗液sIgA含量在第24 小时即明显升高，第72 小时开始下降，第168 小时则明显回落。用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠sIgA水平在第72 小时开始明显上调，并达到高峰( P ＜ 0． 01) ，随后有所下降，但仍明显高于模型组( P ＜ 0． 01) 。说明肉苁蓉多糖可以提高气切后大鼠肺泡灌洗液sIgA 含量，且在第72 小时上调sIgA 含量的效果达到高峰。见表3。

2． 3 大鼠外周血IL － 2 含量气管切开后，大鼠外周血IL － 2 水平在第72 小时升高( P ＜ 0． 05 ) ，其余时段无明显改变( P ＞0． 05) 。使用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠外周血IL － 2 含量在第24 小时即明显升高，提高程度与用药时间呈正比，在第168 小时达到高峰( P = 0． 002、0． 000、0． 000) 。提示肉苁蓉多糖对气管切开留置大鼠血清IL － 2 的含量具有明显的上调作用，上调程度随着时间延长而逐渐明显增强。见表4。

2． 4 大鼠外周血IL － 6 含量正常组大鼠外周血IL － 6 含量3 个时间段表达无统计学差异。气管切开后大鼠外周血IL － 6 含量在第24 小时即明显升高( P ＜ 0． 01) ，在第72 小时稍有下降，至第168 小时再次回升。用肉苁蓉多糖干预后，其含量在第24 小时即显著降低，在第168 小时达最低值( P 均= 0． 000 ＜ 0． 01) 。提示肉苁蓉多糖可以降低气管切开留置大鼠外周血IL － 6的含量，下降程度随用药时间延长而逐渐明显。见表5。

3 讨论

肉苁蓉属于补肾阳类中药，最早记载于《神农本草经》，是“上品”类中药，具有补肾壮阳、添精补髓、养血润燥等功效，临床上辨证运用于肾阳不足、精血亏虚、腰膝酸软、肠燥便秘等症。现代药理发现肉苁蓉具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫功能、调节神经内分泌等作用［7］。寻找肉苁蓉发挥作用的有效成分成为目前的课题之一。肉苁蓉多糖属于肉苁蓉主要有效成分之一，具有促进淋巴细胞增殖［8］，改善机体免疫功能，激活免疫细胞、抗氧化、护肝［9］等药理作用。本实验发现，肉苁蓉多糖可以通过上调气管切开插管留置大鼠肺组织rBD2 mＲNA 的表达和肺泡灌洗液sIgA、外周血IL － 2 含量，同时降低外周血IL － 6 的含量，从而达到改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。气管切开后，极易发生肺部感染。炎症因子释放、免疫功能低下是气管切开插管后并发肺部感染的重要因素［10］。rBD2 主要来源于唾液腺导管细胞、呼吸道上皮细胞和一些受病原体刺激的血细胞，并在呼吸道黏膜上皮的防御中起重要作用［11］，其表达水平的高低受微生物及炎症反应的影响，反过来rBD2 的表达也影响机体炎症反应状态［12］。sIgA 主要存在于乳汁、胃肠液、呼吸道分泌液等外分泌液中，是黏膜分泌的最重要的体液免疫分子，具有抗感染保护作用［13］。IL － 2 和IL － 6 均属于免疫系统产生的细胞因子。其中IL － 2 对T 细胞的增殖、分化具有促进作用，其表达的升高能够增强机体细胞免疫功能［14］。而IL － 6 属于促炎因子之一，在病理状态下，其表达的增高能引起免疫性病理损伤，加重炎症反应［15］。本实验结果显示，气管切开插管留置大鼠肺组织rBD2 mＲNA及肺泡灌洗液sIgA 含量的表达量在第24 小时升高，随后开始降低，其中rBD2 mＲNA 的表达在第72 小时显著低于正常大鼠，至第168 小时更加明显。提示气管切开后，大鼠肺部免疫功能在短时间内出现暂时增强，随后肺部免疫功能逐渐降低。这与临床上急重症患者行气管切开术后，患者肺部感染的发生率随时间逐渐增加相一致［16］。张冉令等［17］在对气管切开插管留置大鼠的研究中，发现其研究结果与本实验基本一致。同时，气管切开插管留置大鼠外周血IL － 6 水平在第24 小时即明显升高，72小时稍有下降，第168 小时与正常组大鼠比较无统计学差异，外周血IL － 2 水平在第72 小时升高，其余时段与正常组大鼠比较无统计学差异，提示气管切开后炎症反应出现，可能引发短暂的刺激性免疫应答。

在用肉苁蓉多糖干预后，气管切开插管留置大鼠肺组织rBD2、肺泡灌洗液sIgA 及外周血IL － 2 的含量均出现不同程度升高。其中肺组织rBD2 和外周血IL － 2 水平在第24 小时即明显升高，提高程度与用药时间呈正比，在第168 小时达到高峰，而肺泡灌洗液sIgA 含量在第72 小时达到高峰，与此同时，其外周血IL － 6 含量在第24 小时即显著降低，降低程度与用药时间呈正比，在第168 小时降至最低。这个结果提示，肉苁蓉多糖可能是从两个方面调节大鼠肺部免疫功能，其一是通过促进rBD2、sIgA及IL － 2 等含量的表达，增强肺部免疫功能，其二则通过降低外周血IL － 6 的水平抑制炎症反应，进一步改善气管切开插管留置大鼠肺部免疫功能。

参考文献:

［1］ 张娜娜． 肉苁蓉多糖对更年期高血压燥证大鼠内分泌功能调节的研究［J］． 中医药学报，2018，46( 1) : 65．

［2］ 张涛，许文胜，贾彦斌，等． 肉苁蓉多糖对THP － 1 细胞吞噬作用的影响及其机理研究［J］． 生命科学研究，2013，17( 2) : 148．

［3］ 马慧，尹若熙，郭敏，等． 肉苁蓉多糖对D － 半乳糖致衰老模型小鼠CＲEB 表达的影响［J］． 中国实验方剂学杂志，2014，20( 20) :137．

［4］ 黄文川，潘宇政，张冉令，等． 肉苁蓉对气管切开插管大鼠肺部病理及肺泡灌洗液SP － A 浓度的影响［J］． 辽宁中医杂志，2016，43( 11) : 2436．

［5］ 朱翠香，彭玲玲，潘宇政． 一次性硬膜外麻醉导管气管切开插管留置大鼠模型建立［J］． 中华实验外科杂志，2015，10( 32) : 2480．

［6］ 徐叔云． 药理实验方法学3 版． ［M］． 北京: 人民卫生出版社，2001: 202．

［7］ 薛海燕，焦婵媛，姚军． 肉苁蓉总苷药理作用的研究现状［J］． 中国临床药理学杂志，2018，34( 4) : 486．

［8］ 曾群力，郑一凡，吕志良． 肉苁蓉多糖的免疫活性作用及机制［J］．浙江大学学报( 医学版) ，2002，31( 4) : 60．

［9］ Guo Y，Cao L，Zhao Q，et al． Preliminary characterizations，antioxidantand hepatoprotective activity of polysaccharide from Cistanche deserticola［J］． Int J Biol Macromol，2016，93( Pt A) : 678．

［10］ 张冉令，潘宇政，黄文川，等． 骨碎补对气管切开插管留置套管大鼠外周血β － 防御素－ 2 及IL － 2 和肺泡灌洗液sIgA 的干预作用［J］． 中华中医药杂志，2017，32( 4) : 1712．

［11］ Abiko Y，Saitoh M． Salivary defensins and their importance in oralhealth and disease［J］． Curr Pharm Des， 2007，13( 30) : 3065．

［12］ Masuda N，Mantani Y，Yuasa H，et al． Immunohistochemical study onthe distribution of β － defensin 1 and β － defensin 2 throughout the respiratorytract of healthy rats［J］． Vet Med Sci，2018，80( 3) : 395．

［13］ Moraes H，Aoki MS，Freitas CG，et al． SIgA response and incidence ofupper respiratory tract infections during intensified training in youthbasketball players［J］． Biol Sport， 2017，34( 1) : 49．

［14］ van Brummelen EMJ，huisman MC，de Wit － van der Veen LJ，et al．Zr － labeled CEA － targeted IL － 2 variant immunocytokine in patientswith solid tumors: CEA － mediated tumor accumulation and role of IL －2 receptor － binding［J］． Oncotarget， 2018，9( 37) : 24737．

［15］ Norelli M，Camisa B，Barbiera G，et al． Monocyte － derived IL － 1and IL － 6 are differentially required for cytokine － release syndromeand neurotoxicity due to CAＲ T cells［J］． Nat Med， 2018，24( 6) : 739．

［16］ 曾上飞，王丹丹，朱国文，等． 颅内血肿清除术后气管切开患者肺部感染因素研究［J］． 中华医院感染学杂志，2017，27( 2) : 359．

［17］ 张冉令，潘宇政，黄文川，等． 基于β － 防御素－ 2 的中药骨碎补对气管切开留置气管套大鼠肺部免疫功能的干预作用［J］． 时珍国医国药，2016，27( 10) : 2365．