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徐圣，柴莎莎
（武汉职业技术学院生物工程学院，湖北 武汉430074）
摘要：建立HPLC-DAD同时检测肉苁蓉中主要活性物质7种苯乙醇苷类成分的快速分析方法。使用Agilent ZORBAX C18色谱柱（150mmx4.6mm，5μm），以乙精-0.1％甲酸为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器，波长330nm，外标法定量。7种苯乙醇苷类成分在检测范围内有良好的线性，相关系数均在0.9995以上，检出限为0.5-2μg／mL，定量限为2-10μg／mL。在3个水平下加标园收率为85.12％-97.21％，相对标准偏差低于5％。该方法快速、准确、简便，适用于肉苁蓉苯乙醇苷类成分的检测需求，后续可以为控制肉苁蓉质量提供有力支持和有效保障。
关键词：HPLC；内苁蓉；活性物质；检测；质量控制
肉苁蓉又名苁蓉、大芸、金笋、地精，为列当科植物肉苁蓉的带鳞片的干燥肉质茎，最早在《神农本草经》中有所记载吧，被列为上品。其味甘、咸，性温。归肾、大肠经，具有补肾阳、益精血、润肠通便的功能，用于肾阳不足，精血亏虚，阳痿不孕，腰膝酸软。筋骨无力，肠燥便秘。肉苁蓉主要产地是内蒙古、新疆、甘肃、宁夏等地。
到目前为止，已经从肉苁蓉中分离出了多种类型的物质，主要可分为苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、多糖、生物碱等网。现代药理研究表明，苯乙醇苷类物质具有保肝、抗氧化、清除自由基、保护神经、改善习记忆、免疫调节等作用，苯乙醇苷类物质是肉苁蓉抗衰老、抗疲劳、补肾助阳、抗老年性痴呆等药理作用的主要活性成分网，是评价肉苁蓉质量及鉴别肉苁蓉真伪的重要指标。
随着人们对健康重视，肉苁蓉近年来逐渐成为大众的关注重点，目前肉苁蓉已被国家批准为新食品原料，未来肉苁蓉在食品领域的研究具有很大的潜力。但是目前市场上的肉苁蓉存在着品种混乱，真伪混杂，质量不一等一系列的问题。
本研究采用HPLC-DAD法建立肉苁蓉中主要活性成分苯乙醇苷类物质的快速检测方法，可同时测定麦角甾苷、异麦角甾苷、管花苷A、2＇-乙酰毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷A、肉苁蓉苷F、松果菊苷7个苯乙醇苷类成分，实现快速的定性、定量。存在着品种混乱、质量不一、真伪混杂等一系列问题。
一、材料与方法
（一）材料与试剂
麦角甾苷对照品（纯度98％）、异麦角甾苷对照品（纯度98％）、松果菊苷对照品（纯度98％）、管花苷A对照品（纯度98％）、2＊-乙酰毛蕊花糖苷对照品（纯度98％）、肉苁蓉苷A对照品（纯度98％）、肉苁蓉苷F对照品（纯度98％），成都曼思特生物科技技术有限公司；甲醇（色谱纯），Fisher公司；乙腈（色谱纯），Fisher公司；甲酸（色谱纯）.Fisher公司；水为屈臣氏纯净水，市购：
试验采用的肉苁蓉原料采自主产区，经湖北省中医药研究院鉴定为肉苁蓉，共10批，见表1。
表1肉苁蓉原料产地信息
编号 |
批号 |
来源 |
批号 |
批号 |
来源 |
1 |
190315 |
新疆 |
6 |
190312 |
新疆 |
2 |
190701 |
新疆 |
7 |
190611 |
内蒙古 |
3 |
190721 |
新疆 |
8 |
190722 |
内蒙古 |
4 |
200311 |
新疆 |
9 |
200112 |
内蒙古 |
5 |
200311 |
新疆 |
10 |
200923 |
内蒙古 |
（二）主要仪器与设备
1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司，配有二极管阵列检测器：SB-800D数显普通型超声波清洗机：宁波新芝公司；XSR105电子天平：美国梅特勒公司。十万分之一天平：美国梅特勒公司；DJ-04B小型破碎机：上海鼎广机械设备有限公司。ZORBAXC18色谱柱（150mmx4.6mm，5μm）：美国安捷伦公司。
（三）方法
1．溶液配制
（1）标准溶液
分别精密称取麦角甾苷对照品20mg，异麦角甾苷对照品20mg，松果菊苷对照品20mg、管花苷A对照品10mg、2＇-乙酰毛蕊花糖苷对照品10mg、肉苁蓉苷A对照品10mg、肉苁蓉苷F对照品10mg，于25mL 容量瓶中，以甲醇-水（1：1）混合溶液定容至刻度，即得各标准溶液储备液。分别取各对标准溶液储备液适量于量瓶中，甲醇-水（1：1）混合溶液定容至刻度，即得标准混合溶液
（2）样品溶液
取肉苁蓉粉末，过4号筛，精密称取1g，置100mL棕色量瓶中，加入甲醇-水（1：1）50mL，盖上瓶塞，摇匀，称定质量，然后浸泡30min，超声处理40min后放置室温，再称定质量，加甲醇-水（1：1）补足减失的质量，摇匀，静置，取上清液［1］，过0.45μm
滤膜，备用。
2．色谱条件
以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B．进样量10微升，柱温30℃，检测波长为330nm，梯度洗脱程序见表2。
表2梯度洗脱程序
时间（min） |
流动相A（％） |
流动相B（％） |
流速（mL／min） |
0 |
90 |
20 |
0.4 |
10 |
80 |
20 |
0.4 |
22 |
0 |
40 |
0.4 |
25 |
60 |
40 |
0.4 |
28 |
30 |
70 |
0.4 |
30 |
30 |
70 |
0.4 |
二、结果与讨论
（一）流动相条件的优化
1．流动相的选择
比较甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水和乙腈-甲酸水系统溶液梯度洗脱对7种目标物的分离效果，结果表明，在相同色谱条件下，不加甲酸，各组分峰形较差，有明显的拖尾现象：使用甲醇-0.1％甲酸水溶液，各组分的峰出现较密集，而使用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱时，7个苯乙醇苷类成分均可获得良好的分离度和峰形。因此采用乙腈-0.1％甲酸水溶液作为流动相对7种苯乙醇苷类物质进行色谱分离。
2．波长的确定
通过紫外吸收光谱对7种苯乙醇苷类成分进行全波长扫描，发现7个苯乙醇苷类成分在330nm处有最大吸收，故确定本实验的测定波长为330nm。
3．柱温的选择
比较了25℃，30℃，35℃柱温条件下，对7种苯乙醇苷类成分的分离效果，结果表明在相同色谱条件下，30℃时分离效果最好，确定本实验的柱温为30℃。
（二）线性方程、线性范围和检出限
按照2．色谱条件，依次对7种苯乙醇苷类成分的系列标准工作溶液进样分析，以保留时间定性，色谱峰面积定量。以质量浓度为横坐标，色谱峰的面积为纵坐标，进行线性回归，绘制标准曲线。将信噪比等于3时的7种苯乙醇苷类物质对应的浓度作为检测限，信噪比等于10时对应的7种苯乙醇苷类成分浓度作为定量限，得到各苯乙醇苷类成分的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限，结果见表3。
表3 7种苯乙醇苷类物质的线性回归方程、相关系数、检测限和定量限
对照品 |
标准曲线R2 ( |
检测限 |
定量限 |
μg/mL) |
(μg/mL) |
||
麦角甾苷 |
y=29.71x+42.746 0.9997 |
0.4 |
2 |
异麦角留苷 |
y=22.939x+22.569 0.9998 |
0.5 |
4 |
松果菊苷 |
y-23.087x+26.118 0.9999 |
0.5 |
4 |
管花苷A |
y=43.163x+9.4738 0.9996 |
0.5 |
4 |
2＇-乙酰毛 蕊花糖苷 |
y=17.656x-10.493 0.9996 |
0.5 |
4 |
肉苁蓉苷A |
y=19.948x+10.462 0.9997 |
2 |
10 |
肉苁蓉苷F |
y=31.918x+7.874 0.9995 |
1 |
6 |
由表3可知．7种苯乙醇苷类成分在各自线性范围内与色谱峰面积线性关系良好。7种苯乙醇苷类物质的检测限在0.4-2μg／mL．之间，定量限在2-10μg／mL．之间。
（三）精密度实验
吸取同一混合标准品溶液，上机验证精密度，分别重复测定6次，记录7种苯乙醇苷类成分的峰面积，并计算相对标准偏差，结果列于表4。结果表明7种苯乙醇苷类成分的峰面积对应的RSD值分别为1.52％、1.29％、1.79％、1.67％、1.80％、1.67％、1.71，表明该方法精密度良好。
四）稳定性试验
精密吸取同一混合标准品溶液10μL，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，分别重复测定3次，计录各特征峰的相对保留时间及相对峰面积，计算RSD值。结果表明7种苯乙醇苷的特征峰的相对保留时间的RSD＜0.5％，峰面积的RSD值分别为1.85％、0.92％、1.63％、0.87％、1.24％、1.65％、1.43％，峰面积的RSD＜2％，故7种苯乙醇苷类成分于24h内测定结果稳定。
（五）回收率实验
对7种苯乙醇苷类物质在1.5、20mg／kg3个水平下进行加标回收实验，平行测定6次，计算加标回收率，结果见表5。7种苯乙醇苷类物质的回收率在85.12％～97.21％之间，相对标准偏差RSD均低于5％，由此可以看出表明该方法精密度良好，结果稳定。
表5 7种苯乙醇苷类物质方法平均回收率和相对标准偏差
对照品 |
1mg/kg 回收率／％RSD/% |
5mg/kg 回收率％RSD/% |
20mg/kg 回收率％RSD/% |
||
麦角甾苷85.12 异麦角甾苷87.20 松果菊苷90.45 管花苷A 89.54 2＇-乙酰毛蕊花糖苷 91.24 肉苁蓉苷A 87.64 肉苁蓉苷F 92.36 |
2.23 92.5 3.62 95.6 2.89 97.21 1.24 92.15 3.67 94.28 2.56 87.26 |
0.89 91.50 3.11 2.12 95.14 1.64 4.08 94.25 241 2.24 86.27 1.25 3.25 91.64 3.65 4.25 87.56 2.74 |
|||
（六）实际样品的测定
分别按方法制备供试品样品，测定色谱峰面积。由标准曲线计算7种苯乙醇苷类成分含量。测定10个批次的样品，每个样品重复测定3次，结果见表6。
表6含量测定结果及相对标准偏差
样品 |
麦角甾苷 含量RSD (%) (%) |
异麦角甾苷 |
松果菊苷 |
肉苁蓉苷A |
肉苁蓉苷F 含量RSD (%) (%) |
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