摘要目的：观察肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其作用机制。方法：将SPF级SD 雌性大鼠随机分成对照组、模型组、治疗组，按相关方法造模。骨折造模24h 后，对照组和模型组分别予以生理盐水灌胃，治疗组予肉苁蓉水提液灌胃，每日1 次，干预2 周、6 周后腹主动脉取血分离血清检测其中白介素-1β（IL-1β）与转化生长因子-β1（TGF-β1）水平，同时收取骨折标本，固定后行Micro-CT 扫描，测量ROI 骨痂骨体积分数（BV/TV）等相关参数，再经脱钙、脱水、包埋后制成蜡块待用。结果：骨质疏松造模6 周后，模型组与治疗组大鼠骨密度均低于对照组（P＜0.05），但治疗组与模型组间差异不明显，治疗组在干预2 周、6 周后骨密度虽然仍低于对照组，但明显高于模型组（P＜0.05）。Micro-CT 扫描显示治疗组BV/TV、Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI 在干预后2 周、6 周均优于模型组，且对照组BV/TV、Tb.Sp、SMI 参数与治疗组差异不明显，而模型组2 时间点Micro-CT 参数均劣于对照组。干预2 周、6 周后，比较3 组血清IL-1β、TGF-β1 水平发现治疗组IL-1β 水平2 周时均低于其他两组，6 周时，虽然治疗组IL-1β 水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；TGF-β1 水平方面，治疗组在2 周、6 周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。结论：依据骨密度、Micro-CT 扫描参数分析及血清IL-1β、TGF-β1 水平，发现肉苁蓉水提物可促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1β 和促进TGF-β1 分泌，进而改善骨质疏松、促进骨折愈合有关。

关键词骨质疏松性骨折肉苁蓉骨折愈合大鼠

骨质疏松症是一种以骨密度降低与骨组织微细结构破坏，骨脆性增加的一种疾病，患者可在日常生活中受轻微外力下引起骨折，是临床常见病、多发病。且这一类骨折因患者多为老年人，常合并其他疾病，且骨折多为粉碎性，稳定性差，骨折愈合迟缓或不愈合时有发生，存在较高的致残率、致死率[1]。目前有关其治疗主要是通过手术、手法整复联合抗骨质疏松治疗，缺少骨质疏松骨折患者针对性治疗药物，而中药治疗骨质疏松历史悠久，疗效肯定，许多中药被证实既可改善骨质疏松同时还可促进骨折愈合。肉苁蓉属于常用补肾阳代表药，具有补益肝肾作用。中医学认为，肾主骨，骨折治法也多不离补肾益精，现代药理学发现肉苁蓉还具有一定雌激素样作用[2]。本研究拟通过骨密度测量、Micro-CT 和血清白介素-1β（IL-1β）、转化生长因子-β1（TGF-β1）水平观察并肉苁蓉水提物对大鼠骨质疏松性骨折愈合的影响并初步探索其内在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂器材：体重210～250gSPF 级雌性SD 大鼠52 只，饲养于浙江中医药大学动物实验中心。络合碘，杭州朗索医用消毒剂有限公司，批号20160720；青霉素，华北制药股份有限公司，批号F3117217；IL-

1β 试剂盒（批号：20160715）、TGF-β1 试剂盒（批号：20160722）；双能X 线骨密度扫描仪，OSTEOCORE2；Micro-CT，Skyscan1176。

1.2 肉苁蓉水提液提取：将碾碎肉苁蓉（浙江中医药大学药厂）10 倍超纯水浸泡0.5 小时，煎锅煎煮1.5 小时，重复提取2 次，混合药液旋蒸仪浓缩至浓度1.5g/ml，存放4℃冰箱备用。

1.3 造模制备：分述如下。

1.3.1 骨质疏松模型：大鼠造模前适应性饲养1 周后随机分成对照组、模型组、治疗组，分别16 只、18 只、18只，每组依2 周、6 周时间点各分成两小组，治疗组和模型组均1% 戊巴比妥钠麻醉（0.4ml/100g）后备皮、消毒、铺巾、切开皮肤后摘除大鼠双侧卵巢，对照组仅切开不摘除卵巢。

1.3.2 骨折模型：骨质疏松造模后6 周后准备制备骨折模型，各组大鼠麻醉后行股骨中段骨密度测定，完成后取大鼠右侧股骨中段进行备皮、消毒、铺巾、切开，行股骨中段横行骨折造模[3]，并以1mm 克氏针固定，消毒缝合切口皮肤。

1.4 药物干预：造模术后行股骨X 线检测，剔除模型制备失败大鼠，并在造模后肌注8 万单位青霉素预防感染。术后24h 治疗组开始予肉苁蓉水提物灌胃（浓度1.5g/ml，1g/kg，每日1 次），对照组与模型组则予同体积生理盐水灌胃。

1.5 样本收取：干预后2 周、6 周后收取大鼠样本，各组大鼠1% 戊巴比妥钠麻醉后，腹主动脉取血5～10ml 制备血清，储存于-20℃冰箱备用。然后处死大鼠，收取股骨骨折样本，并置于10% 中性甲醛固定72 小时。

1.6 检测指标：分述如下。

1.6.1 骨密度：所有骨质疏松造模后大鼠，行骨折造模前均麻醉后行股骨中段骨密度测定。3 组大鼠在干预2周、6 周后收取样本，样本在固定72 小时后再次行骨密度测定。

1.6.2 Micro-CT：样本固定72 小时后进行Micro-CT 扫描，以骨折端上下各200 张图片作为感兴趣区域(ROI)，扫描角度360° ，电流555uA、电压42kV，滤光片Al0.2mm，分辨率8.73μm，完成后进行骨痂三维图像重建与分析。检测参数如下：骨体积分数BV/TV、骨小梁模式因子(Tb.Pf)；结构模型指数(SMI)等[4]。

1.6.3 血清IL-1β、TGF-β1 测定：从-20℃冰箱解冻各组大鼠血清，分别按照IL-1β 和TGF-β1 试剂盒说明书逐步进行检测。

1.7 统计学方法：采用统计分析软件SPSS.19 进行处理。实验数据均用以均数±标准差（-x ±s）表示，3 组大鼠骨密度、Micro-CT 参数、IL-1β、TGF-β1 水平均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，检验水准为P＜0.05。

2.2 Micro-CT 二维截面：矢状位二维截面选取各组各时间点股骨纵轴中心截面图片（见图1），水平面二维截面图则选取骨折线下第100 图片进行对比（图2），从图中可见各组骨痂随时间逐渐增多，但在骨折后6 周不同程度塑性；同时可见对照组骨痂体积大，6 周后骨痂皮质厚实并爬过骨折线，而模型组2 周时骨痂骨质较少，6周后骨痂皮质稀松，治疗组2 周时骨痂体积虽不大，但骨痂中骨质较模型组多，6 周后骨痂塑形较好且骨折线不明显。

2.3 Micro-CT 三维重建：股骨中段骨折端骨痂三维重建见图3。从图3 可见各组骨折后2 周骨痂沿骨折线两端骨膜形成，但各组骨折线仍然清晰，模型组与治疗组尤为明显，而骨折6 周后对照组骨痂厚实，多以板状骨小梁为主，骨折线消失，而模型组骨质稀松，骨折线较模糊，但治疗组骨痂骨质较多，骨小梁规则且厚实，骨折线不明显。

3 讨论

近年来，中药淫羊藿、骨碎补及复方（青娥丸、六味地黄丸等）在临床实践中被证实可明显改善骨质疏松症候[1]，这类中药及复方多以补益肝肾为主，这与骨折中后期补肾续筋原则一致[5]。肉苁蓉始载于《神农本草经》，李时珍曰：“此物补而不峻，故有从容之义”，苁蓉味甘、咸，性温，具有补肾壮阳、填精补髓、养血润燥、悦色延年之功[6]。本研究中，干预2 周、6 周后治疗组骨密度均高于模型组（P＜0.05），Micro-CT 扫描BV/TV 参数显示治疗组在干预后两个时间点结果与骨密度测定结果一致，而BV/TV 是骨质疏松性骨折愈合评估的重要指标，直接反映骨痂骨质含量，这说明肉苁蓉可能具有促进成骨的作用，分析原因可能与肉苁蓉中有效成分具有上调BMP2作用有关[7]，而BMP2 为TGF-β 家族中成员之一。并且这一结果也被Micro-CT 扫描其他参数（Tb.Sp、Tb.N、Tb.Th、SMI）所印证，Tb.Sp、SMI 反映的是骨痂生物力学特性，治疗组中数值明显优于模型组，这也进一步提示肉苁蓉具有改善骨量丢失，促进成骨进而加快骨折愈合的作用。

在血清IL-1β、TGF-β1 水平方面，干预2 周、6 周后发现治疗组IL-1β 水平2 周时均低于其他两组，在6周时，虽然治疗组IL-1β 水平高于对照组，但仍明显低于模型组（P＜0.05）；而治疗组TGF-β1 水平，在2 周、6周时均高于模型组和对照组，且与对照组间差异无统计学意义。而IL-1β 水平直接影响破骨细胞的分化与活性，其水平升高将会促进骨吸收，抑制成骨细胞增殖、分化，但TGF-β1 则与骨性干细胞增殖、分化、迁移密切相关，具有促进软骨和骨痂形成[2]，加快骨痂塑形的作用，这提示肉苁蓉改善骨量丢失，促进成骨，加快骨折愈合作用可能通过降低骨质疏松性骨折大鼠IL-1β 水平、抑制破骨细胞活性实现；此外可能还与肉苁蓉可升高骨折大鼠TGF-β1 水平，促进成骨分化与骨痂成熟塑形有关。

综上所述，依据骨密度、Micro-CT 扫描参数分析及血清IL-1β、TGF-β1 水平，发现肉苁蓉水提物可改善骨丢失，促进骨质疏松性骨折愈合，而其机制可能与其可抑制骨质疏松骨折后大鼠血清IL-1β 分泌和促进TGF-β1 分泌，进而改善骨质疏松、促进骨折愈合有关。

4 参考文献

[1]马远征,王以朋,刘强,等. 中国老年骨质疏松症诊疗指南(2018)[J]. 中国骨质疏松杂志,2018,24(12)：1541-1567.

[2]朱刚,孙海斌,徐刚,等. 肉苁蓉醇提物对去卵巢骨质疏松大鼠的治疗作用及其机制[J]. 吉林大学学报( 医学版),2018,44(1)：68-72.

[3]Karvande A, Khedgikar V, Kushwaha P, et al. Heartwoodextract from Dalbergia sissoo promotes fracturehealing and its application in ovariectomy-inducedosteoporotic rats[J]. Journal of Pharmacy and

Pharmacology,2017,69(10)：1381-1397.

[4]Kevin O'Neill, Christopher M S, Nicholas A M, etal. Micro-computed tomography assessment of the progressionof fracture healing in mice[J]. Bone, 2012,(6)：1357-1367.

[5]姚新苗,史晓林,王健,等. 浙江省中医药防治原发性骨质疏松症分级诊疗专家共识(2017)[J]. 浙江中医杂志,2018,53(4)：237-241.

[6]马猛,张志国,马晓辉. 单味及复方中药防治骨质疏松症的研究进展[J]. 中国医药导刊,2018,20(8)：477-481.

[7]张跃全,郑丹红,许建峰,等. 荒漠肉苁蓉对快速老化骨质疏松小鼠BMP-2 蛋白表达的影响[J]. 宁夏医学杂志,2014,36(12)：1114-1116.