杨秀梅，杨 雨，王丹阳，张爱莲

（新疆大学生命科学与技术学院，新疆生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐830046）

摘要：旨在探讨新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物（ethanol extracts of wild Cistanche deserticola，EEWCD）调节 Thl／Th2免疫反应的特点及初步的作用机制，采用卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）为抗原，研究EEWCD对小鼠体液免疫，细胞免疫，细胞因子分泌，树突状细胞（dendritic cells，DCs）的成熟和调节性T器胞（regulatory T cell，Treg）等的影响。EEWCD低、中、高剂量（分别记作L、M、H）分别与OVA混合．ICR小鼠随机分为0.9％ NaCl，EEWCD、OVA．OVA-EEWCD-L．OVA-EEWCD-M．OVA-EEWCD-H和OVA-铝佐剂免疫组。皮下免疫2次，间隔2周。小鼠免疫后，ELISA法检测抗体滴度及分型，MTT检测牌细胞增殖水平，FACS 检测CD4＊IL-4．CD4＋IFN-y和CD8＋IFN-y的水平，以及DCs表面分子与Treg表达水平。结果显示，EEWCD提高了OVA特异性1gG抗体2～3倍：在初次免疫后21d显著促进1gG，和1gG的表达水平（P＜0.05）；显著促进OVA特异性脾细胞增殖以及T／B细胞的活化（P＜0.05）；显著促进CD4＋IL-4，CD4＊IFN-y和CD8＋IFN-y的分泌（P＜0.05），同时，EEWCD也星著促进了DCs的CD40，CD80，CD86和MHCI的表达（P＜0.05），下调了Treg的水平（P＜0.05）。EEWCD-M为最佳剂量。监测免疫后小鼠行为及体重，小鼠行为没有异常，且同一时间点各组体重之间差异不显著（P＞0.05）。综上表明，EEWCD能够促进OVA特异性的Th／The免疫反应，尤其促进Th型反应，具有良好的免疫调节活性，其作用机制可能为通过激活DCs的成熟，促进1L-4和1FN-y的分泌，降低Treg的水平调节Thi／Th免疫反应的动态平衡。

关键词：醇提物：新疆野生荒漠肉苁蓉：Th／The反应；免疫增强；树突状细胞

中图分类号：S853.74       文献标志码：A      文章编号：0366-6964（2021）03-0820-11

中草药含有多种免疫调节成分，中草药中的黄酮、多糖以及皂苷等具有良好的免疫调节作用近年来，中草药活性成分作为有效的免疫刺激物在防治人和动物多种疾病中发挥了重要的作用。补益类中药一般均能较好地增强机体的免疫功能，提高机体的免疫力，且对正常细胞没有毒副作用，是良好的生物反应调节剂，作为天然、安全生物活性成分的来源用于动物和人类传染病的防治有着不可替代的优势。

新疆荒漠肉苁蓉（Cistanche deserticola）为列当科植物，产于我国新疆等荒漠化干旱地区，是一种具有极高药用价值的中草药，有“沙漠人参”的美誉，作为补益类中药在中国等地被普追用作滋补食品已有多年历史，研究者对肉苁蓉已经做了大量的研究，主要针对肉苁蓉有效成分分离、药理作用，药物疗效，肉苁蓉的化学组成等方面开展了深入面细致的研究，分离了百余种化合物，包括苯乙醇苷、木脂素类及生物碱和多糖等成分，可以增强机体的免疫功能，具有抗衰老、抗氧化以及免疫调节等作用。由于不同中草药的活性成分含量有很大的差别，从具有免疫活性的中草药中进行广泛筛选，寻找合适的中草药活性成分对于动物和人类各种疾病的防治具有实际的意义。

为了阐明新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物对特异性免疫反应的调节性质和强度，基于中药有效成分可通过激活抗原提呈细胞树突状细胞（dendriticcells，DCs）的成熟和功能面发挥重要的免疫调节作用，本研究以新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物为研究材料，OVA为抗原，采用皮下途径免疫小鼠，检测体液和细胞免疫反应，以及促进DCs成熟和对Treg的影响，通过深入探究新疆野生荒漠肉苁蓉醇提物对OVA特异性免疫应答的特点和作用机制的初步研究，为筛选具有良好免疫调节作用的中草药活性成分的研究和新型疫苗佐剂的发现提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健康ICR小鼠，雌性（5～6周龄，体重18～22g）购于新疆医科大学动物中心，进行适应性饲养1．周后开始试验。新疆野生荒漠肉苁蓉（EEWCD，其中，苯乙醇苷类化合物含量为17.12％，作者实验室制备）；OVA、噻唑蓝（MTT）、刀豆蛋白A（concanavalin A.ConA）和脂多糖（lipopolysac charide，LPS）均购自 Sigma公司：铝佐剂（ImjectAlum Adjuvant，Alum）购自 Thermo公司；羊抗鼠过氧化物酶抗体（IgG-HRP、IgG1-HRP、IgG2aHRP）购自美国Southern Biotech 公司：Cytofix／ Cytoperm buffer、Perm/Wash buffer、CD4-FITC、 CD8-FITC、IL-4-PE、IFN-y-APC,CD11c-PE、CD40-FITC，CD80-APC、CD86-APC和MHCII-FITC抗 体购自BD公司。Treg染色试剂盒购自 eBio-science公司，其他各类试剂和耗材均为国产或进口产品。

1.2 免疫及分组

EEWCD用Tween-20：0.9％ NaCl＝1：9溶解。EEWCD与溶解在0.9％ NaC1的OVA配制成疫苗后备用，小鼠免疫抗体检测分组见表1，共分为7组，每组5只小鼠，0.9％ NaCl组为空白对照组，EEWCD为对照组，Alum和OVA为阳性对照组，其他组为试验组。皮下免疫两次，间隔2周，免疫前眼眶采集小鼠血，制备血清后用于抗体检测。MTT、细胞因子、DCs及Treg检测采用同样的策略免疫小鼠，免疫分组见表1，在抗体检测分组的基础上增加了Tween-20为对照组。

表1 小鼠抗体水平、MTT检测分组设计（n＝5）

Table 1 The group of antibody,MIT detection in immunized mice(n=5)

1.3 EEWCD免疫小鼠后抗体滴度及亚类检测

EEWCD与OVA皮下免疫小鼠后，小鼠眼眶采血，收集初免疫后各个时间点血清，间接ELISA法检测OVA特异性IgG抗体滴度及分型：将OVA抗原（2.5μg＊mL-）包被96孔板后4℃过夜。将稀释好的血清加入到96孔板中37℃孵育1b．接着，加入IgG-HRP、IgG，-HRP和IgGz-HRP的抗 体稀释液到96孔板中，37℃避光1h，加入TMB显色液，避光显色10～20min后，加入终止液终止反应，酶标仪上检测ODs／ODs的值。

1.4 EEWCD免疫小鼠后对脾细胞增殖的检测

ELISA 检测初次免疫后21d小鼠血清中IgG抗体水平，验证抗体有效后，采用MTT法检测EEWCD对牌细胞的增殖作用：制备初次后21d牌单细胞悬液，加入96孔细胞培养板后，分别加入20；L浓度为10μg·mL-的OVA，10μg·mL-的OVA 5μg＊mL-的ConA和5pg·mL-的LPS刺激 细胞48h，设置3个复孔，未处理的空细胞和空培养基为对照。刺激后加入20L的5mg·mL-的MTT，37℃孵育3～4h，弃上清后，加入DMSO溶解甲瓒颗粒后，检测ODm／OD-值，计算刺激指数SI（stimulation index，SI）：（OD-ODasa)/(ODe-ODana)。

1.5 FCAS检测胞内细胞因子

采用 FACS 进行CD4＊IL-4、CD4＋IFN-y和CD8＋IFN-y的检测，具体步骤：初次免疫后21d，制备脾单细胞悬液，将细胞浓度调整为2x10个·mL-，单细胞悬液铺到24孔板细胞培养中，OVA刺激4h，加入Golgi stop 继续孵育12h，收集细胞，Perm／Washing buffer洗涤2次，先进行细胞表面分子CD4-FITC和CD8-FITC染色，避光20 min，细胞用 Cytofix／Cytoperm buffer 进行固定和破膜后，Perm／Washing buffer洗涤细胞后，分别加入IL-4和IFN-y，避光孵育15～20 min，Perm／Wash buffer洗涤细胞后，FACS检测，FlowJo 7.6 软件分析检测结果。

1.6 FCAS检测DCs表面分子

采用FCAS检测 EEWCD对小鼠脾中DCs的成熟和Treg的影响：制备初次免疫后21d脾单细胞悬液，用PBS洗涤细胞后，进行DCs表面分子