CD11c-PE、CD40-FITC、CD80-APC、CD86-APC和 MHCII-FITC避光染色 20 min．FACS检测，Flow-Jo分析结果。

1.7 FCAS检测CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 细胞

用eBioscience试剂盒进行检测EEWCD对小鼠CD4＋CD25Foxp3＋Treg 细胞的影响，具体操作：PBS洗涤牌单细胞，CD4-APC和CD25-FITC细胞避光染色20min，用eBioscience Fixation／Perme-abilization buffer的进行固定破膜细胞，室温孵育20 min，Permeabilization buffer 洗涤后，加入PBS 后，FCAS检测，FlowJo分析结果。

1.8 EEWCD对小鼠生长状况的影响

EEWCD皮下免疫小鼠后，在免疫前和免疫后不同时间点观察小鼠行为，测量小鼠体重，观察小鼠的日常行为，同时，检测EEWCD免疫后对小鼠体重的影响，初步判断EEWCD免疫小鼠后的安全性。

1.9 数据分析

试验组与对照组的差异通过One-way ANO-VA分析后，用Turkey＇s post-test进行多重比较分析差异性。试验数据采用“x士s”表示。GraphPadPrism 5.0进行绘图和数据分析。P＜0.05表示差异显著。

2结果

2.1 EEWCD对OVA特异性抗体滴度的影响

为了检测 EEWCD对体液免疫的影响，采用ELISA检测了初免后14、21、35和49d小鼠血清中OVA特异性的抗体滴度。从图1中可以看出，EE-WCD的抗体滴度与0.9％NaCl空白对照组相当，免疫后各组的抗体滴度随着免疫时间的增加抗体水平有所增加，与OVA处理组相比，EEWCD-M组和EEWCD-H组在21、35和49d均能够提高OVA特异性抗体2倍左右，抗体滴度为18万～24万，Alum组的抗体滴度为24万～30万。EEWCD-M组和EEWCD-H组抗体水平高于EEWCD-L组，EEWCD-M为最佳剂量组，Alum组为抗体水平最高剂量组。这些结果表明，EEWCD可以提高体液免疫水平。

图1 初免后不同时期EEWAR对OVA特异性抗体滴度的影响（n）Fig.1 Detection of IgG titer in different time after immunization(n)

2.2 EEWCD对OVA特异性抗体亚类的影响

小鼠初免后35d对其抗体分型进行了检测，图2的结果表明，EEWCD-M和EEWCD-H极显著促进OVA特异性1gG水平（P＜0.01），显著促进了IgG1的水平（P＜0.05），与铝佐剂没有显著差异（P＞0.05）；EEWCD-M极显著促进lgGa的水平（P＜0.01）．与Alum相比差异显著（P＜0.05），EE-WCD-H显著促进IgG2的水平（P＜0.05），与Alum相比差异不显著（P＞0.05）。这表明EEWCD不仅可以提高体液免疫水平，也可以促进Th，和Th2的免疫反应，与Alum相比，尤其是可以促进Th，的反应。

2.3 EEWCD对脾细胞增殖的影响

采用MTT法进行了EEWCD对小鼠脾细胞增殖的检测。首先，采用间接ELISA 检测小鼠初免后21d抗体水平，如图3A所示，EEWCD-L、EE-WCD-M和EEWCD-H均能够显著或极显著促进抗体水平（P＜0.05或P＜0.01）．Alum 也能够极显著促进抗体水平（P＜0.05），EEWCD-M为最佳剂量，且与Alum之间无显著差异（P＞0.05）。在

与OVA组相比，＊．P＜0.05：＊＊．P＜0.01；与Alum组相比，＊．P＜0.05

Compared with OVA group.*.P<0.05;··.P<0.01;Compared with Alum group.".P<0.05

图2 EEWCD对OVA特异性抗体亚型的影响（n＝5）

Fig.2 Effects of the EEWCD en OVA-specific IgG subclasses(n=5)

此基础上，采用MTT法检测了EEWCD对脾细胞增殖的影响，如图3B-E所示，在OVA和OVA刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M和EEWCD-H均能 够显著或极显著促进牌细胞增殖水平（P＜0.05或P＜0.01），EEWCD-M和EEWCD-H的刺激作用 显著高于Alum（P＜0.05）．EEWCD-M为最佳剂量。在ConA和LPS刺激下，EEWCD-L、EEWCD-M、EEWCD-H和Alum对脾细胞增殖的作用也达到了显著或极显著的水平（P＜0.05或P＜0.01），EEWCD-M和EEWCD-H显著高于Alum（P＜ 0.05），且EEWCD-M为最佳剂量。试验结果表明，EEWCD可以促进OVA特异性的脾细胞增殖。

2.4 EEWCD对T细胞分泌细胞因子的作用

细胞因子在调节免疫细胞功能和防御感染中起重要的作用。为了检测EEWCD对IL-4和IFN-Y分泌的影响，EEWCD加强免疫7d后，分离制备小鼠脾单细胞悬液，与OVA抗原体外共培养后进行CD4＋／IL-4、CD4＊／IFN-y、CD8＋／IFN-Y染色， FACS检测结果如图4．EEWCD-M显著促进CD4＋T细胞IL-4和IFN-y的分泌（P＜0.05），与Alum相比差异显著（P＜0.05）；EEWCD-M极显著促进CD8＋T细胞IFN-y的产生（P＜0.01），与Alum相比差异显著（P＜0.05）。综上表明．EEWCD可以促进细胞因子的产生，尤其促进了IFN-y的产生。

2.5 EEWCD对DCs成熟的影响

DCs在调节免疫反应中发挥了重要的作用，采用FACS检测了初免后21d小鼠脾细胞中DCs共刺激分子CD80、CD40．CD86和MHCII的表达水平，探究EEWCD对DCs成熟的影响。从图5可以看出，EECCD-M极显著CD40的表达水平（P＜0.01）．EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H 均能够极显著促进CD80和MHCII的表达（P＜0.01），与Alum相比差异显著（P＜0.05）。EWC-CD-M、EWCCD-H和Alum可以显著增强CD86的 表达（P＜0.05），与Alum相比差异不显著（P＞0.05）。这些结果表明，EEWCD可以促进DCs的成熟，

2.6 EEWCD对Treg的影响

为了更好地了解EEWCD在免疫应答中的调节作用，小鼠加强免疫后7d，利用FACS检测了CD4＋CD25＊Foxp3＊Treg细胞的变化。如图6所示，与OVA组相比，EECCD-L、EWCCD-M和EWCCD-H极显著降低了CD4＊CD25＊Foxp3＋ Treg频率（P＜0.01），Alum 也极显著降低了 Treg频率（P＜0.01），EWCCD处理组和Alum组没有显著差异，EEWCD可以显著下调Treg的水平。

2.7 EEWCD免疫小鼠对体重的影响

EEWCD免疫小鼠后，观察小鼠的日常行为，每周称量小鼠的体重，观察整个免疫期间EEWCD对小鼠的影响。在整个免疫期间小鼠无任何异常行为，如没有脱毛、拒食等现象，在同一时间点，各组体重之间无显著差异（P＜0.01），同一组小鼠随着免疫时间的延长体重也在不断增加，详见表2