李亚，潘志强，谢海纳，方肇勤

上海中医药大学基础医学院（上海 201203）

【摘要】目的：研究温补肾阳中药及其配伍对虚证模型小鼠肾上腺皮质激素合成的影响，方法：120只维性ICR小鼠随机分成10组．即对照组、模型组、淫羊藿（5.3mg＊kg＇·d＇）组、仙茅（4.3mg＊kg＊·d＇）组、巴戟天（4.3mg＊kg·d）组、杜仲（5.3mg＊kg＊·d）组、补骨脂（5.3mg＊kg＇·d）组、菟丝子（6.0mg＊kg＇·d＇）组·肉苁蓉（5.3mg＊kg＇·d）组以及配伍（各单味中药等比例混合，4.7mg＊kg＊d＇）组，每组12只。除对照组外，其他各组小鼠灌胃给予0.66mg＊kg＊＊d氢化可的松溶液，连续14d，以复制药源性虚证模型，造模同时，各中药干预组及配伍组小鼠灌胃给予相应药液，连续14d．末次给药后，称量小鼠体质量：采集血清和双侧肾上腺组织。ELISA检测血清皮质酮含量：PCR检测肾上腺相关基因的表达，包括类固醇激素合成酶（Cypllal、Cyp2lal、Cypl1b1、Hsd3b1），胆固醇转运分子（Star、StarD3．Npe1、Npe2）、胆固醇摄取分子（Ldlr、Scarbl）、胆固醇合成限速酶（Hmger）、胆固醇储存分子（Lipe．Acatl）、胆固醇流出分子（Abcal、Abegl）、胆固醇稳态分子（Sreb2、Nrlh3）：Western blot 检测肾上腺 CYPIIAI．CYP21A2、HSD1IBI．SAR．NPCI．NPC2．LDLR、SRBI、HSL、ACATI的蛋白表 达，

结果：

①与模型组相比，各中药干预组及配伍组小鼠的体质量和血清皮质酮含量无明显变化（P＞0.05）。

②与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Cyp2lal mRNA表达和CYPIIAI蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，淫羊藿组和仙茅组Cyp2lal mRNA表达明显上调（P＜0.05），各中药组及配伍组CYP11A1蛋白表达呈上调趋势。

③与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Stur和Npel的mRNA表达及SAR和NPCI蛋白表达显著降低（P＜0.05．P＜0.01），NPC2蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，淫羊藿组、仙茅组、杜仲组、菟丝子组及配伍组SLAR 蛋白表达明显升高（P＜0.05，P＜0.01），各中药组NPCI蛋白表达量增多，以补骨脂作用最为显著（P＜0.05），除杜仲组外其他中药干预组及配伍组NPC2蛋白表达明显下调（P＜0.01）。

④与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Lllr、Scarbl的mRNA表达以及LDLR、SRBI的蛋白表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，仙茅组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组Ldlr mRNA表达明显下调（P＜0.01），杜仲组、菟丝子组及配伍组SRBI蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

⑤模型组小鼠肾上腺Hmger mRNA表达及HSL蛋白表达较对照组显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，仙茅组，巴戟天组、杜仲组、补骨脂组、肉苁蓉组Hmger mRNA表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01），淫羊藿组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组HSL蛋白表达明显降低（P＜0.05．P＜0.01）。

⑥模型组小鼠肾上腺Abegl mRNA表达较对照组显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，除肉苁外其他各中药干预组及配伍组的Abegl mRNA表达均显著降低（P＜0.05．P＜0.01）。

⑦模型组小鼠肾上腺Sebl2mRNA表达较对照组显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，补骨脂组·肉苁蓉组及配伍组Scebf2 mRNA表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01），且补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组Nrlh3 mRNA表达显著降低（P＜0.05）。结论：温补肾阳中药可调节氢化可的松诱导的虚证模型小鼠肾上腺皮质激素的合成能力，其中以淫羊藿、仙茅、杜仲、菟丝子的作用较为显著。

【关键词】 温补肾阳：肾上腺皮质：氢化可的松：虚证：小鼠

证候是中医基础理论研究的主要领域。本课题组前期研究采用0.66mg＊kg·d氢化可的松连续给药14d的方法建立稳定的药源性脾肾虚证模型，模型小鼠肾上腺皮质功能受到显著抑制＂。温补肾阳中药对肾上腺皮质激素的合成与分泌具有明显的调节作用。临床中，在小剂量糖皮质激素维持治疗阶段，患者可出现肢倦神疲、少气懒言、腰膝酸软、头晕耳鸣、畏寒、肢冷、舌淡苔白、脉细等虚证征象，故常给予温补肾阳中药以改善证候，并通过血液激素的动态变化评价药效。但临床研究难以直接观察肾上腺皮质激素合成的多环节、多靶点的变化。

为了进一步明确温补肾阳中药对肾上腺皮质功能的调节作用，本研究拟复制药源性脾肾虚证小鼠模型，并给予温补肾阳中药淫羊藿、仙茅、巴戟天、杜仲、补骨脂、菟丝子、肉苁蓉及其配伍组合进行干预，基于肾上腺皮质细胞合成与分泌皮质酮的生化过程，深入探讨温补肾阳中药对肾上腺皮质功能的影响。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性ICR小鼠120只，SPF级，体质量20～22g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2013-0016，动物合格证号：2008001685725。所有动物均饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室，饲养室温度22～25℃，湿度50％～60％，12h明暗交替，可自由饮水，予普通饲料喂养。

1.1.2 药物与试剂 氢化可的松，国药集团化学试剂有限公司（批号：66003632）。淫羊藿（批号：180915）、仙茅（批号：180914）、巴戟天（批号：180425）、杜仲（批号：180915）、补骨脂（批号：180131）、菟丝子（批号：181008）、肉苁蓉（批号：180717），均购自上海康桥中药饮片有限公司。水煎法制备各单味中药及组合（等比例配伍）的药液，浓缩至1g／ml。

TRIzol 试剂、PrimeScript®RT试剂盒、SYBR® Premix Ex Taqt（Tli RNaseH Plus）试剂盒，日本 TaKaRa公司；小鼠皮质酮ELISA检测试剂盒（货号：501320），美国Cayman公司；兔抗低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor，LDLR.货号： ab52818）抗体、兔抗B族I型清道夫受体（scavengerreceptor class B type I．Scarbl／SRBI，货号：ab52629）抗 体、兔抗类固醇合成急性调节蛋白（steroidogenesisacute regulatory protein，StAR，货号：ab96637）抗体、兔抗胆固醇侧链裂解酶（cholesterol side-chaincleavage enzyme P450scc，编码基因 Cypllal，货号： ab175408）抗体、兔抗胆固醇酰基转移酶1（acyl-CoA：cholesterol acyltransferase-1，ACATI，货号： ab168342）抗体、兔抗激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglayceride lipase，Lipe／HSL，货号： ab109400）抗体、兔抗胆固醇21-羟化酶（21-hydroxylase，编码基因 Cyp21a2，货号：ab232701）抗 体、兔抗11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1．HSD11B1，货号： ab39364）抗体、兔抗尼曼匹克CI前体蛋白（Niemann pick Cl protein precursor，NPCI，货号： ab134113）抗体、兔抗尼曼匹克C2前体蛋白（Niemann pick C2 protein precursor，NPC2，货号： ab218192）抗体，美国Abeam公司：小鼠 β-actin抗体，美国Sigma-Aldrich公司：RIPA裂解液、ECL化学发光试剂、辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记的山羊抗兔／小鼠IgG（H＋L），上海碧云天生物试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器 MP200B型电子天平，上海良平仪器仪表有限公司：Synergy2多功能酶标仪，美国Bio Tek 公司：Eco实时荧光定量PCR仪，美国IHlumina公司：电泳仪及转膜设备，美国 Bio-Rad公司：Alpha 化学发光凝胶成像系统，美国 ProteinSimple公司。

1.2 分组与造模 小鼠适应性饲养后，待体质量达30g时，随机分为对照组、模型组、淫羊藿组、仙茅组、巴戟天组、杜仲组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组、配伍组，每组12只。除对照组外，其他各组小鼠每日上午9：00灌胃给予0.66mg＊kg＇·d＇氢化可的松溶液，连续14d，以复制药源性脾肾虚证模型：对照组小鼠灌胃给予等体积0.9％NaCl溶液。

1.3 药物干预 造模同时，各中药干预组每日下午3：00灌胃给予相应中药水煎液，给药剂量为：淫羊藿5.3mg·kg＇·d＇．仙茅4.3mg·kg＇·d＇，巴戟天4.3mg＊kg＇·d＇＇，杜仲5.3mg·kg＇·d＇，补骨脂5.3mg＊kg＇·d＇，菟丝子6.0mg·kg＇·d＇，肉苁蓉5.3mg＊kg＊d．配伍组4.7mg＊kg＇＊d，剂量设置依据《中华人民共和国药典》（2015版）各中药用量，取临床等效剂量的4倍；对照组和模型组灌胃给予等体积灭菌水；每日给药1次，连续14d。末次给药后，称量小鼠体质量：采集血液，分离血清；收集小鼠双侧肾上腺组织。