1.4 检测指标与方法

1.4.1 体质量 末次给药后，记录每只小鼠的体质

量，比较组间体质量的差异。

1.4.2 ELISA检测血清皮质酮含量 取每只小鼠血液样本．4℃条件下4000r／min离心15min，分离血清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，检测血清皮质酮含量。

1.4.3 PCR 检测相关基因表达 取小鼠肾上腺组织，加入TRIzol试剂抽提总RNA。应用PrimeScriptRT试剂盒进行逆转录反应，制备CDNA.逆转录反应体系为60μl，反应程序为：37℃．15 min；85℃，5s：4℃终止。以β-actin为内参进行荧光定量PCR扩增，以检测各组小鼠肾上腺组织中皮质酮合成相关基因的表达，扩增反应体系为20μl，反应程序为：95℃变性3min，95℃退火30s，60℃延伸30s，共40个循环。扩增引物由Primer3（v．0.4.0）在线软件设计、美国 Life Technologies 公司合成，引物序列见表1．各组均设4个复孔。采用2法表示各目的基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.4.4 Westen blot 检测相关蛋白表达 取小鼠肾上腺组织，置于含有500 μl RIPA裂解液的EP管中，冰上超声研磨后，4℃条件下14000 r／min 离心15 min，收集上清液。BCA法测定总蛋白浓度。各孔取15μg蛋白上样，于10％SDS-PAGE 凝胶进行蛋白分离（浓缩胶电压80 V．30 min：分离胶电压120 V．90 min）。将分离后的蛋白电转移（恒流250 mA，150min），加入5％脱脂奶粉或5％牛血清白蛋白封闭1.5h．洗膜（即加入TBST溶液，置于摇床上振荡，清洗3次，每次10min，下同）后，分别加入一抗抗体（ACATI抗体的体积稀释比例为1：1000．β-nctin抗体的体积稀释比例为1：20 000，HSL抗体的体积稀释比例为1：50000．其他抗体的体积稀释比例均为1：2000），4℃孵育过夜。次日洗膜后，加入HRP标记的山羊抗兔／小鼠IgG（体积稀释比例为1：2000），室温孵育1.5h。洗膜后依据说明书滴加显色剂进行曝光，采用ImageJ图像分析管理系统对蛋白条带灰度值进行分析。1.5 统计学方法 实验数据采用GraphPad Prism

7.0软件进行统计学分析和作图。计量资料以±表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用LSD-检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对体质量的影响 与对照组相比，模型组小鼠体质量显著降低（P＜0.01），各中药干预组与配伍组小鼠的体质量亦明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，各中药干预组与配伍组小鼠体质量无明显变化（P＞0.05）。见图1．

图2 各组小鼠血清皮质酮含量比较（n＝12，x±s）

2.3 对皮质酮合成酶表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺 Cyp2lal mRNA表达显著降低（P＜0.01）：与模型组相比，补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组的图2 各组小鼠血清皮质酮含量比较（n＝12，x±s）

2.3 对皮质酮合成酶表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺 Cyp2lal mRNA表达显著降低（P＜0.01）：与模型组相比，补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组的Cypllb1 mRNA 表达明显下调（P＜0.01），面淫羊藿组和仙茅组 Cyp2lal mRNA表达明显上调（P＜0.05）。见图3A。

与对照组相比，模型组小鼠肾上腺CYP11A1蛋白表达显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，各中药及其配伍作用后，CYP11A1蛋白表达呈上调趋势，CYP21A2和HSD11B1蛋白表达呈下调趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图3B、图3C。

2.4 对皮质酮合成起始过程胆固醇转运分子表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Star和Npel的mRNA表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，各中药干预组Star、StarD3、Npel、Npe2的mRNA表达均无显著变化，仅巴戟天组 Npc2mRNA表达明显降低（P＜0.05）。见图4A。

与对照组相比，模型组小鼠肾上腺StAR和NPCI蛋白表达显著降