与对照组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，**P<0.01

图6 各组小鼠肾上腺Hmgcr mRNA表达比较（n＝4，x±s）

2.7 对皮质酮合成前期胆固醇储存过程相关分子表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺Lipe和Acatl的mRNA表达无显著变化（P＞0.05）；与模型组相比，各中药及其配伍干预后，Lipe和Acatl的mRNA表达均无显著变化（P＞0.05）。见图7A。

与对照组相比，模型组小鼠肾上腺HSL蛋白表达显著降低（P＜0.01），但ACATI蛋白表达无显著变化（P＞0.05）。与模型组相比，淫羊藿组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组HSL蛋白表达明显降低（P＜0.05，P＜0.01）：各中药干预组的ACATI蛋白表达量呈增多趋势，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图7B、图7C。

（A）PCR检测肾上腺Lipe 和Acal的mRNA相对表达量比较（n＝4．i）；（B）Wetem biot 检测 HSL和ACATI蛋白表达条带：（C）Wetemblot 检测HSL和ACATI的蛋白相对表达量比较（n＝3．±）。与对照组比较，＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

图7 各组小鼠腎上腺胆固醇储存相关分子表达比较

2.8 对皮质酮合成前期胆固醇流出过程相关分子表达的影响 与对照组相比，模型组小鼠肾上腺三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 A1（ATP-binding cassettetransporter A1，Abcal）mRNA 表达无明显变化，但三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 G1（ATP-binding cassettetransporter G1．Abegl）mRNA 表达显著升高 （P＜0.01）。与模型组相比，各中药干预组及配伍组Abeal mRNA 表达均无明显变化：除肉苁蓉组外，其他各中药干预组及配伍组的Abegl mRNA表达均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。见图8。

Abcal

与对照组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05．**P<0.01

与对照组比较，＃P＜0.01；与模型组比较，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01图9 各组小鼠肾上腺胆圆醇稳态相关分子表达比较（n＝4，±x）

3 讨论

本研究采用0.66mg·kg＇·d氢化可的松连续给药14d的方法诱导药源性脾肾虚证模型，模型小鼠体质量和血清皮质酮含量降低，肾上腺皮质酮合成酶以及细胞内胆固醇代谢相关基因与蛋白表达异常，下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴功能受到显著抑制，这与课题组前期研究结果一致。临床常用的温补脾肾中药能够改善糖皮质激素诱发的虚证，但具体作用机制尚未明确，故本研究探讨常用温补肾阳中药对氢化可的松诱发的药源性虚证小鼠肾上腺皮质功能的影响，检测皮质酮合成前期胆固醇利用以及皮质酮合成生化过程有关分子的表达变化。

肾上腺皮质是肾上腺外层的内分泌腺组织，受脑垂体前叶分泌的促肾上腺皮质激素调控，产生肾上腺皮质激素（糖皮质激素和盐皮质激素）。皮质酮是啮齿类动物分泌的有活性的糖皮质激素。本研究检测了皮质酮合成酶 Cypllal、Cyp2lal、Cypl1b1、Hsd3b1的mRNA表达，结果显示模型组小鼠肾上腺Cyp2lal mRNA表达显著降低，淫羊藿和仙茅作用后Cyp2lal mRNA表达明显上调：从蛋白表达层面分析，模型小鼠肾上腺CYP11A1蛋白表达显著降低，各中药及其配伍作用后，CYP11A1蛋白表达呈上调趋势。这些结果提示，小剂量氢化可的松连续给药14d可抑制肾上腺皮质细胞的皮质酮合成，淫羊藿、仙茅有助于提升肾上腺皮质细胞的皮质激素合成能力。动物体内皮质酮分泌受HPA轴调控，而温补肾阳中药干预后，模型小鼠血清皮质酮含量无明显变化，提示温补肾阳中药对氢化可的松诱导的药源性虚证的改善作用以调节肾上腺皮质激素合成的功能分子为主。

类固醇激素的合成以胆固醇为原料，涉及多种酶，经过多个步骤的生物转化过程。本研究检测了胆固醇代谢过程中不同阶段的相关分子表达，在皮质酮合成起始阶段，模型小鼠肾上腺SIAR和NPC1的mRNA及蛋白表达均显著降低，NPC2蛋白表达显著升高，提示氢化可的松小剂量给药可影响细胞内胆固醇运输至线粒体的过程。与模型组相比，淫羊藿组、仙茅组、杜仲组、菟丝子组及配伍组SLAR蛋白表达明显升高；各中药干预组NPC1蛋白表达量增多，其中以补骨脂作用最为显著；除杜仲组外，其他中药干预组及配伍组 NPC2蛋白表达均明显下调，提示温补肾阳中药可以纠正氢化可的松诱导的胆固醇转运紊乱。

血液中的胆固醇由肾上腺皮质束状带细胞膜上LDLR和SRBI两种受体摄取，并通过StAR蛋白转运至细胞线粒体内。检测皮质酮合成前期胆固醇摄取过程相关分子，模型小鼠肾上腺皮质细胞膜LDLR、SRBI的mRNA和蛋白表达均显著降低，仙茅组、补骨脂组、菟丝子组、肉苁蓉组及配伍组 LdlrmRNA表达较模型组明显下调，提示仙茅、补骨脂、菟丝子、肉苁蓉可能进一步抑制肾上腺皮质细胞对血液中胆固醇的利用。

Hmger是胆固醇合成的限速酶。本研究结果显示，氢化可的松作用使Hmger mRNA表达显著下调.而仙茅、巴戟天、杜仲、补骨脂、肉苁蓉作用后该基因表达进一步下降，提示仙茅、巴戟天、杜仲、补骨脂、肉苁蓉单独干预或加重氢化可的松诱导的肾上腺皮质细胞胆固醇合成过程障碍。

激素敏感性脂肪酶是脂肪动员阶段的关键限速酶之一ml，ACATI可催化细胞内游离胆固醇生成胆固醇酯。各中药及其配伍干预后，Lipe和Acatl的mRNA表达均无显著变化，提示温补肾阳类中药对胆固醇储存过程无明显影响。

Abcgl和Abcal 负责胆固醇的流出，两者在外周组织细胞胆固醇的逆向转运过程中发挥协同作用，且Abcgl介导的胆固醇逆向转运是Abcal转运能力的有益补充。氢化可的松和温补肾阳中药对小鼠Abeal 基因表达无明显影响，但温补肾阳中药能够显著抑制氢化可的松诱导的Abcgl 基因高表达，提示温补肾阳中药可通过下调Abegl 表达抑制肾上腺皮质细胞内胆固醇的流出过程，有助于保障皮质激素合成所需的原料。

Srebf2和Nrlh3参与细胞内胆固醇稳态的调节。小剂量氢化可的松作用导致Srebf2 mRNA表达显著下调，而补骨脂组、肉苁蓉组及配伍组Srebf2、Nrlh3的mRNA表达明显低于模型组，提示补骨脂、肉苁蓉单独用药或加剧细胞内胆固醇稳态失调。

综上所述，0.66mg＊kg＇·d氢化可的松连续给药14d可引起小鼠肾上腺皮质功能抑制，表现为皮质酮合成酶（Cyp2lal、CYP11A1）表达下调以及皮质酮合成前期胆固醇转运（SIAR和NPCI表达下调、NPC2表达上调）、摄取（LDLR和SRBI下调）、合成（Hmger表达下调），流出（Abegl表达上调）、稳态（Srebf2表达下调）过程异常。温补肾阳中药可调节肾上腺皮质激素合成能力，上调Cyp2lal、CYPIIAI、SLAR、NPCI表达，下调NPC2和Abegl表 达，其中以淫羊藿、仙茅、杜仲、菟丝子的作用较为显著。