摘要：目的　探讨音猬因子（Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）通路在实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠发病过程中的作用，及肉苁蓉多糖（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＤＰＳ）能否通过该通路缓解ＥＡＥ小鼠临床症状。方法　给予Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下注射髓鞘少突细胞糖蛋白３５－５５多肽（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３５－５５，ＭＯＧ３５－５５）抗原制备ＥＡＥ动物模型。将６０只小鼠随机分为正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＣＤＰＳ治疗组以及ＣＤＰＳ＋Ｓｍｏ受体阻断剂环王巴明（ｃｙｃ）治疗组（以下简称ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组）４组，每组各１５只。观察各组小鼠免疫注射后０～２６ｄ的临床症状评分，采用勒克斯光蓝染色（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ，ＬＦＢ）检测各组小鼠脊髓组织内髓鞘脱失情况，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测脊髓组织内Ｓｈｈ、碎片蛋白－１（Ｐａｔｃｈｅｄ－１，Ｐｔｃ－１）蛋白表达，采用ＲＴ－ＰＣＲ检测脊髓组织内平滑蛋白（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，Ｓｍｏ）ｍＲＮＡ、神经胶质瘤相关癌基因１（Ｇｌｉｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｏｎｃｏｇｅｎｅ－１，Ｇｌｉ１）ｍＲＮＡ表达。结果　自ＣＤＰＳ治疗第９天开始，ＣＤＰＳ治疗

组小鼠临床症状评分低于ＥＡＥ模型组（Ｐ＜０．０５），而ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组临床症状评分高于ＣＤＰＳ组（Ｐ＜０．０５）。ＣＤＰＳ治疗组小鼠脊髓ＬＦＢ评分较ＥＡＥ模型组降低（ｔ＝９．６４，Ｐ＜０．０１），而ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组其ＬＦＢ评分与ＥＡＥ模型组比较差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。ＥＡＥ模型组小鼠脊髓组织内Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白以及ＳｍｏｍＲＮＡ、Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达水平较正常组升高（均Ｐ＜０．０１），经ＣＤＰＳ治疗后，上述因子表达进一步升高（均Ｐ＜０．０１），而经ｃｙｃ干预后，上述因子表达较ＣＤＰＳ治疗组降低（均Ｐ＜０．０１）。结论　ＣＤＰＳ对ＥＡＥ小鼠临床症状有改善作用，其作用途径可能与Ｓｈｈ信号通路有关。

关键词：肉苁蓉多糖；脑脊髓炎，自身免疫性，实验性；Ｓｈｈ通路；神经保护

多发性硬化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）是一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫性疾病，其主要病理特征为髓鞘脱失、轴索损伤、少突胶质细胞病变，受损后神经细胞的修复和

再生对中枢神经系统的功能重建尤为重要［１］。Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｈｈ）信号通路在神经系统的发育过程中起非常重要的作用［２］，音猬因子（ｓｏｎｉｃｈｅｄｇｅｈｏｇ，Ｓｈｈ）是Ｈｈ家族三大配体成员之一，

Ｓｈｈ信号通路的主要成分包括Ｓｈｈ配体、跨膜蛋白受体Ｐｔｃ和平滑蛋白（ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ，Ｓｍｏ）及下游转录因子神经胶质瘤相关癌基因（ｇｌｉｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｏｎｃｏｇｅｎｅ，Ｇｌｉ）蛋白等。近年来有报道证实Ｓｈｈ信号通路在促进神经再生、少突胶质细胞发生混合轴突重塑方面有重要作用，对ＭＳ等神经退行性疾病的发生有重要影响［３］。

目前临床上治疗ＭＳ的手段主要有糖皮质激素冲击和免疫调节治疗［４］，但疗效并不理想且副作用较大。肉苁蓉多糖（ｃｉｓｔａｎｃｈｅ　ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＣＤＰＳ）是从肉苁蓉中提取的化学成分，具有免疫调节、抗衰老、抗肿瘤等功能［５］。有研究证实，ＣＤＰＳ能通过多种机制改善帕金森病、缺血性脑卒中小鼠中枢神经功能［６－７］，但其对ＭＳ的受损神经是否具有保护作用尚未可知。本研究观察了ＣＤＰＳ对实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠中枢神经的作用，并探讨其可能机制，为ＭＳ的临床治疗寻找更安全有效的药物。

１　材料和方法

１．１　实验动物　ＳＰＦ级雌性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠６０只，周龄８～１０周，体重１８～２０ｇ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。建模前将实验动物在ＳＰＦ级环境下饲养１周。将小鼠随机分为正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＣＤＰＳ治疗组及ＣＤＰＳ＋Ｓｍｏ受体阻断剂环王巴明（ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅ，ｃｙｃ；以下简称“ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组”）４组，每组１５只。

１．２　主要试剂　髓鞘少突细胞糖蛋白３５－５５多肽（ｍｙｅｌｉｎ　ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　３５－５５，ＭＯＧ３５－５５）购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，完全福氏

佐剂（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ，ＣＦＡ）购自美国Ｓｉｇｍａ公司，百日咳毒素（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｔｏｘｉｎ，ＰＴＸ），购自美国Ｓｉｇｍａ公司，ｃｙｃ购自美国Ｃａｙｍａｎ公

司，肉苁蓉生药由本院中药房提供，Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１、β－ｃａｔｅｎｉｎ引物由上海生工生物工程有限公司合成，Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、ＧＡＰＤＨ 抗体购自碧云天生物技术研究所。

１．３　方法　

１．３．１　ＣＤＰＳ提取：肉苁蓉生药片１０ｇ，研磨成碎片，置９５％（体积分数）乙醇中浸泡３ｈ后用纱布过滤，弃滤液，加水反复煎煮３次，２ｈ／次，过滤后合并滤液，减压浓缩体积至原生药溶液体积的２／３，

以５０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径１５ｃｍ）离心１０ｍｉｎ，弃沉淀，上清液加２～３倍体积９５％（体积分数）乙醇，４℃下静置２４ｈ后以３０００ｒ／ｍｉｎ（离心半径１５ｃｍ）离心２０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀经水复溶、脱蛋白透析、冷冻干燥，获取多糖共２．２０ｇ。紫外分光光度计测定多糖含量＞９０％。

１．３．２　ＥＡＥ小鼠模型建立［１］：将１０ｍｇ　ＭＯＧ３５－５５溶于２ｍＬ生理盐水，并与含２．５ｍｇ／ｍＬ结核杆菌的ＣＦＡ等体积混合，使用玻璃注射器反复抽打至完全融合，制成油包水样乳剂。以２％（质量浓度）戊巴比妥麻醉按体重３ｍＬ／ｋｇ给予小鼠背部沿脊柱中线两侧分四点皮下注射抗原乳剂０．２ｍＬ，分别于０、４８ｈ给予小鼠腹腔注射ＰＴＸ　２００ｎｇ，建立ＥＡＥ模型。正常对照组小鼠以同法给予背部皮下注射不含ＭＯＧ３５－５５和结核杆菌的乳剂。自免疫当天起，隔天观察并记录小鼠行为特征，采用五分法对小鼠进行神经功能评分［８］：０分，活动正常，无明显临床症状；１分，尾部无力；２分，后肢无力，翻转后可自行恢复；３分，尾部及双后肢瘫痪，翻转后不能自行恢复；４分，四肢瘫痪；５分，濒临死亡或死亡。神经功能评分≥１分即认为发病。共观察２６ｄ。

１．３．３　各组干预措施：（１）ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组：自免疫后第１２天起，每天按体重０．５４ｍｇ／ｇ给予ＣＤＰＳ灌胃（ＣＤＰＳ溶于生理盐水），同时按体重１０ｍｇ／ｋｇ腹腔注射ｃｙｃ，连续２周；（２）ＣＤＰＳ治疗组：自免疫后第１２天起，以同法给予等剂量ＣＤＰＳ灌胃，同时腹腔注射等体积的生理盐水，连续２周；

（３）ＥＡＥ模型组和正常对照组：按上述方法给予等体积的生理盐水灌胃及腹腔注射，持续２周。

１．３．４　组织标本采集：免疫后第２６天，以２％（质量浓度）戊巴比妥麻醉小鼠，预冷生理盐水进行心脏灌注，采集脊髓组织，部分以４％（质量浓度）多聚甲醛固定后制成石蜡切片，剩余组织置－８０℃冷冻保存备用。

１．３．５　勒克斯光蓝（Ｌｕｘｏｌ　Ｆａｓｔ　Ｂｌｕｅ，ＬＦＢ）髓鞘染色［９］：将脊髓腰间膨大组织石蜡切片脱蜡，置于固蓝染液中孵育过夜，９５％（体积分数）乙醇中洗脱１ｍｉｎ，０．０５％（质量浓度）碳酸锂溶液洗脱１０ｓ，乙醇梯度脱水，二甲苯浸泡至透明，中性树胶封片。置光学显微镜下观察髓鞘脱失情况：０分，无脱失，髓鞘完整；１分，１个小范围内脱失；２分，２或３个小范围脱失；３分，１～２个大范围脱失；４分，大范围髓鞘脱失累及２０％以上白质区域。

１．３．６　脊髓组织Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１ 蛋白表达：采用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法检测。将冻存脊髓组织剪成碎块，加蛋白裂解液，离心后取上清液，电泳分离蛋白，将蛋白转移至ＮＣ膜，用含５％（质量浓度）脱脂奶粉的ＴＢＳＴ封闭，按顺序添加一抗、二抗，洗涤ＮＣ膜，ＥＣＬ显色，胶片扫描后用Ｂａｎｄｓｃａｎ５．０软件分析蛋白条带灰度与内参条带灰度比值表示蛋白相对表达水平。

１．３．７　脊髓组织Ｓｍｏ、Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 表达：采用ＲＴ－ＰＣＲ检测。将冻存组织在液氮中研磨，加Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，行逆转录反应。取２μＬ　ＲＮＡ进行ＰＣＲ扩增。β－ａｃｔｉｎ内参引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＡＣＴＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡ－５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＡＴＴＡＣＧＧＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＴ－５′；Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＧＣＴＡＴＴＡＣＧＣＴＴＧＣＴＡＡＣ －５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ： ３′－ＴＣＧＧＣＴＴＡＧＣＴＣＧＡＴＴＡＡＣＣＡ－５′；Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 引物序列：Ｓｅｎｓｅ：３′－ＴＡＴＴＡＧＣＴＴＡＡＣＧＣＴＡＣＣＣＡＡ

－５′；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：３′－ＴＣＧＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＧＣＴＡＧＧ－５′。扩增条件：９５℃ 预变性２ｍｉｎ，１个循环；９５℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸２ｍｉｎ，共３５个循环；７２℃总延伸６ｍｉｎ。取５μＬ　ＰＣＲ扩增产物进行电泳，紫外线投射仪下观察电泳条带，分析目的基因和内参基因的条带灰度。

１．４　统计学处理　采用ＳＰＳＳ１９．０软件进行统计分析，对数据进行正态性和方差齐性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较用ＬＳＤ－ｔ检验。以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果

２．１　临床症状评分　自免疫后第１０天开始，ＥＡＥ小鼠陆续出现临床症状，ＥＡＥ模型组小鼠神经功能评分于２４ｄ达高峰，随后有所缓解；ＣＤＰＳ治疗组小鼠于治疗第９～２６天（免疫后第２０天）开始，其神经功能评分明显低于ＥＡＥ模型组（均Ｐ＜０．０５）；ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组小鼠自治疗第９天（免疫后第２０天）开始，其神经功能评分显著高于ＣＤＰＳ治疗组（均Ｐ＜０．０５），而与ＥＡＥ模型组小鼠比较差异无统计学意义（均Ｐ＞０．０５）。结果见图１。

２．２　ＬＦＢ染色　正常组小鼠髓鞘完整，无脱失；ＥＡＥ模型组小鼠髓鞘密度明显下降；ＣＤＰＳ治疗组小鼠髓鞘ＬＦＢ评分低于ＥＡＥ模型组（１．３０±０．２１比２．５８±０．２５；ｔ＝９．６４，Ｐ＜０．０１）；ＣＤＰＳ＋ｃｙｃ治疗组小鼠髓鞘ＬＦＢ评分与ＥＡＥ模型组比较无统计学差异（２．１３±０．３１比２．５８±０．２５；ｔ＝０．８３，Ｐ＞０．０５）。结果见图２。

２．３　各组小鼠脊髓Ｓｈｈ和Ｐｔｃ－１蛋白表达　ＥＡＥ模型组小鼠脊髓Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达高于正常对照小鼠（ｔ＝８．９７，Ｐ＜０．０１；ｔ＝１４．２８，Ｐ＜０．０１），ＣＤＰＳ治疗组脊髓Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达高于ＥＡＥ模型组（ｔ＝２１．７７，Ｐ＜０．０１；ｔ＝２４．３３，Ｐ＜０．０１），经ｃｙｃ阻断后，Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１蛋白表达较ＣＤＰＳ治疗组低（ｔ＝１２．０３，Ｐ ＜０．０１；ｔ＝１８．６９，Ｐ ＜０．０１）。结果见图３、４。

２．４　各组小鼠脊髓组织Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ 表达　ＥＡＥ 模型组小鼠脊髓组织ＳｍｏｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ ｍＲＮＡ 表达较正常小鼠高（ｔ＝１０．２８，Ｐ＜０．０１；ｔ＝７．２２，Ｐ＜０．０１），经ＣＤＰＳ治疗后Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ表达较ＥＡＥ模型组高（ｔ＝２５．２８，Ｐ＜０．０１；ｔ＝１２．３０，Ｐ＜０．０１），而经ｃｙｃ干预后，其Ｓｍｏ　ｍＲＮＡ 和Ｇｌｉ１ｍＲＮＡ

表达水平与ＥＡＥ模型组比较无统计学差异（ｔ＝１．２５，Ｐ＞０．０５；ｔ＝０．９６，Ｐ＞０．０５），但明显低于ＣＤＰＳ治疗组（ｔ＝１８．３３，Ｐ＜０．０１；ｔ＝２１．０１，Ｐ＜０．０１）。结果见图５、６。

３　讨论

Ｓｈｈ通过与Ｐｔｃ结合可激发Ｓｍｏ活性，继而

引发下游信号通路的级联反应，调节细胞的增殖、分化等活动［３］。前期研究证实，在脑卒中［１０］、ＭＳ［１１］、阿尔茨海默病［１２］等中枢神经受损后，Ｓｈｈ信号通路被激活，继而促进神经细胞再生、少突细

胞发生和轴突修复，而抑制Ｓｈｈ信号通路则加剧脑损伤。Ｚｈａｎｇ等［１３］研究结果显示，脑活素能激活脑卒中实验大鼠中枢神经Ｓｈｈ通路，从而促进中枢神经再生，改善神经功能；Ｃｈｅｃｈｎｅｖａ等［１４］研

究证实Ｓｍｏ受体激动剂能减轻脑缺血性损伤，促进神经功能恢复。Ｙｕ等［１５］研究显示，Ｓｍｏ受体阻断剂ｃｙｃ可抑制Ｓｈｈ信号通路活性，进而导致神经干细胞的增殖活性受到明显抑制。本研究结果发

现，ＥＡＥ小鼠中枢神经系统内Ｓｈｈ信号系统分子Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、Ｓｍｏ和Ｇｌｉ－１的表达明显高于正常小鼠，表明在受损中枢神经内，Ｓｈｈ信号通路被激活，这与前期研究结果一致。

肉苁蓉是列当科植物肉苁蓉的干燥带鳞叶的肉茎，具有免疫调节等作用［５］，对神经系统疾病的防治有显著作用［６－７］。有研究证实，肉苁蓉可以对抗神经细胞内氧化应激反应所造成的ＤＮＡ损伤，维持线粒体膜电位正常，抑制神经细胞的凋亡［１６］；同时，肉苁蓉能降低脑缺血后的梗死范围，保护脑组织的缺血性损伤［１７］；肉苁蓉能通过调控帕金森病模型大鼠中脑黑质－纹状体组织内ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路的表达，发挥中枢神经细胞保护作用［６］。蔡克瑞等［７］研究发现，ＣＤＰＳ对Ｄ－半乳糖致衰小鼠的脑神经细胞具有保护作用，但目前有关肉苁蓉对ＭＳ中枢神经系统是否具有保护作用尚未见报道。本研究结果显示，给予ＥＡＥ小鼠ＣＤＰＳ干预后，ＥＡＥ小鼠神经功能评分明显低于ＥＡＥ模型小鼠，髓鞘脱失情况亦得到显著改善；进一步探讨肉苁蓉对ＥＡＥ小鼠中枢神经系统Ｓｈｈ信号通路是否有调控作用发现，肉苁蓉能上调ＥＡＥ 小鼠脊髓组织内

Ｓｈｈ、Ｐｔｃ－１、Ｓｍｏ和Ｇｌｉ－１的表达，表明ＣＤＰＳ能激活Ｓｈｈ信号通路；当Ｓｈｈ信号通路被ｃｙｃ抑制后，ＣＤＰＳ改善ＥＡＥ小鼠神经功能学及脱髓鞘的作用被抑制，且Ｓｈｈ相关信号分子的表达也较ＣＤＰＳ治疗组下降，表明Ｓｈｈ信号通路在ＣＤＰＳ对ＥＡＥ小鼠的神经保护效应中起到重要作用。综上所述，本研究结果显示ＣＤＰＳ 能改善ＥＡＥ小鼠临床症状，其发挥神经保护作用的途径可能是通过激活Ｓｈｈ信号通路有关。

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