肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)是我国中医用途最广的珍贵中草药之一，习称大芸、苁蓉，为列当科(Orobanchanceae肉苁蓉属(Cistanche)多年生寄生草本植物，专性寄生在藜科(Chenopodiaceae) 梭梭(Haloxylon ammodendron(C.A.Mey)Bunge)和白梭梭(H.Persicum Bungeex Boiss)的根部[1]。主产于我国内蒙、新疆、甘肃、宁夏、青海等省(区)以及伊朗、蒙古、印度等国，其味甘咸微辛酸、微温。在《神农本草经》中将其列为上品，中国药典规定正品为干燥带鳞叶的肉质茎[2-5]。肉苁蓉具有强肝肾，益精血，滑肠通便之功效，动物实验显示有降压作用，其中所含儿茶素具有提高免疫功能、清除自由基、抗氧化作用、防突变、抗癌等活性，与肉苁蓉主要药理作用相吻合[6-8]。本课题经HPLC预试验发现儿茶素含量较高，但中国药典对其含量的测定方法却没有具体标准，而对肉苁蓉中儿茶素的含量测定目前尚未见有文献报道。因此，本文将对肉苁蓉中儿茶素的提取及含量测定进行条件优化及探索，希望找到一条切实可行的测定方法，为今后肉苁蓉的进一步研究开发提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

肉苁蓉产自甘肃省酒泉市瓜州县。

1.2 仪器与试剂

STI 型液相色谱仪(赛智科技有限公司)；SHB-2V 循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；80-2 离心机(江苏大地自动化仪器厂)；BSA124S 型分析天平(赛多利斯科学有限公司)；KQ-500 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。儿茶素标准品购自坛墨质检标准物质中心(批号00003310-QIA)；乙腈、甲醇均为色谱纯；实验用水为超纯水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：KromsstarTM 柱(4.6×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(30︰70，V/V)，流动：相流速为0.8 mL/min；进样量：10 μL；紫外检测波长：260 nm；柱温：25 ℃。

2.2 儿茶素标准曲线的绘制

准确称取105 ℃干燥至恒重的儿茶素标准品 0.0155 g(精确至0.0001 g)，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制0.602 μg/μL 的标准溶液。精密吸取1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL 对照品储备液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，混合均匀，得标准系列溶液。进样并测定峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，计算线性回归方程。

2.3 样品中儿茶素的提取

2.3.1 提取工艺

精密称取晾干并粉碎的肉苁蓉药材2.0000 g，加入15 mL 甲醇，在40 kHz 和50 ℃条件下超声提取30 min，抽滤，滤渣再加入15 mL 甲醇重复提取3 次，抽滤，合并滤液。将滤液浓缩近干，浓缩残余物以甲醇溶解并定容至5 mL，静置过夜。测定前取出，放至室温。取上清液，过0.45 μm 滤膜后进行HPLC 分析。

2.3.2 提取的单因素试验

对可能影响儿茶素得率的几个因素(料液比、超声温度、提取时间、重复提取次数)分别作单因素试验，测定提取液中儿茶素的峰面积值，计算儿茶素含量[9]。

2.3.3 最佳提取条件的选择

以料液比、超声温度、提取时间、重复提取次数为因素，选择L9(34)正交表进行四因素三水平试验，各处理重复3 次，并进行方差分析。

2.4 方法评价

2.4.1 精密度检查

吸取20 μL 样品溶液，重复进样6 次，样品峰面积积分值的RSD 为1.28 %，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性实验

制备5 份样品溶液，分别吸取20 μL 进样，测定，峰面积积分值的RSD 为1.23 %。

2.4.3 稳定性实验

精密吸取同一样品溶液，在12 小时内按0.5 h 的时间间隔重复进样7 次，每次进样20 μL，样品中儿茶素峰面积积分值的RSD为1.94 %。

2.4.4 加标回收率实验

吸取已知浓度的供试品溶液0.5 mL，加入0.602 μg/μL 的儿茶素标准品溶液 0.1、0.2、0.3 mL 稀释至10 mL 混匀，分别进样20 μL 测定其峰面积积分值，求得儿茶素平均回收率为98.56 %。

3 结果与讨论

3.1 色谱分析结果

标准品和样品提取液中儿茶素色谱图分别见图和图2。在该条件下，保留时间3.423 min 处儿茶素可有效分离。

3.2 肉苁蓉中儿茶素提取的单因素试验

3.2.1 料液比

其它实验条件同2.3.1，按不同料比2 g︰10 mL、2 g︰15 mL、2 g︰20 mL、2 g︰25 mL 加入甲醇溶液提取，实验结果见图3。如图可知，料液比对儿茶素的提取有较大影响，最终选择2 g︰15mL 为最佳料液比。

3.2.2 超声温度

其它实验条件同2.3.1，按照不同的超声温度 30、40、50、60、70、80 ℃，实验结果见图4。如图可知，随着温度升高，儿茶素的提取率逐渐上升，50 ℃为最佳提取温度。

3.2.3 超声时间

其它实验条件同2.3.1，按照不同的超声时间10、20、30、40、50、60 min，实验结果见图5。如图可知，随着时间的增加，儿茶素的提取率有所上升，但是在30 min 以后，提取率基本保持不变，因此从节约时间成本的角度考虑选择最佳提取时间为30 min。

3.2.4 提取次数

参照2.3.1 方法分别提取1~4 次，合并滤液分析，实验结果见图7。

3.3 正交试验

在单因素试验基础上，设计料液比、提取温度、超声时间、提取次数的4 因素3 水平正交实验，因素水平见表1，正交试验结果见表2。通过正交试验和方差分析结果表明，影响肉苁蓉儿茶素提取的因素主次顺序为：A＞B＞D＞C，即甲醇体积对儿茶素提取效果影响最大，其次为提取温度和提取次数，超声时间影响较小。综合考虑，儿茶素的最佳提取条件为：甲醇体积25 mL，提取温度60 ℃、提取次数1 次，超声时间30 min。

3.4 肉苁蓉中儿茶素含量的测定

采用标准物加入法对肉苁蓉中儿茶素进行定性，保留时间3.423 min 处色谱峰为儿茶素，见表1、2。通过峰面积定量法计算得到肉苁蓉中儿茶素的含量为26.77 mg/g。

4 结论

本文建立了高效液相色谱法测定肉苁蓉中儿茶素含量的方法，为中药肉苁蓉标准的制定提供依据。通过优化料液比、提取温度、超声时间、提取次数等实验参数，确定儿茶素的最佳提取条件为：甲醇料液比2 g︰25 mL、提取温度60 ℃、提取1 次、超声提取30 min，在此条件下，肉苁蓉中儿茶素含量为26.77mg/g。

参考文献

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